$$\rightleftharpoonup{xx}$$
$$\longleftharp{xx}$$,
$$\longrightharp{xx}$$,
1. Produkcja lentiwirusa
UWAGA: Produkcja i manipulacja wektorami lentiwirusowymi została przeprowadzona zgodnie z wytycznymi National Institutes of Health (NIH) dotyczącymi badań z wykorzystaniem rekombinowanego DNA. Stosuje się plazmid kodujący zmutowany SOD1 typu dzikiego i A4V znakowany wzmocnionym YFP (SOD1WT-YFP i SOD1A4V-YFP). Oba produkty fuzji genów amplifikowano przy użyciu pary starterów PCR 5′-ATCGTCTAGACACCATGGCGACGAAGGTCGTGTGC-3′ i 5′-TAGCGG CCGCTACTTGTACAGCTCGTCCATGCC-3′ i wprowadzono do plazmidu CMV pTRIP-delta U3 przy użyciu miejsc restrykcyjnych XhoI i BsrGI. Unikanie więcej niż 20 przejść i utrzymywanie komórek przy konfluencji mniejszej niż 60% pomaga zapewnić dobrą wydajność transfekcji.
- W dniu 1 rozdziel komórki HEK-293T przy 30-40% zbiegu na płytce do hodowli tkankowej o średnicy 10 cm (3 x 10⁶ komórek/naczynie) w 10 ml pożywki do hodowli komórkowej (DMEM o wysokiej zawartości glukozy z 10% FBS i 4 mM L-glutaminy) w celu produkcji wirusa.
- Płytkę do hodowli tkankowej o średnicy 10 cm należy przechowywać przez noc w inkubatorze wykorzystującym CO₂ (37 °C, 5% CO₂).
- W dniu 2 przygotuj roztwór do transfekcji DNA zawierający 10 μg wektorów lentiwirusowych (pTRIP-delta U3 CMV - SOD1WT-YFP lub -SOD1A4V-YFP) wraz z plazmidami pakującymi lentiwirusa (5 μg pVSVg; 10 μg pCMV-dR8.71) (Figura 1A). Dodać 125 μl 1 M CaCl₂ i dostosować objętość do 500 μl za pomocą wody destylowanej. Delikatnie dodaj 500 μl 0,05 M HEPES do mieszaniny i inkubuj przez 10 minut w temperaturze pokojowej.
- Zastąp pożywkę komórkową HEK-293T 10 ml wstępnie podgrzaną świeżą pożywką hodowlaną, wolną od antybiotyków, zmieszaną z 1 ml roztworu do transfekcji DNA i inkubuj przez noc w temperaturze 37 °C, 5% CO₂.
- W dniu 3 zastąpić supernatant komórek świeżą pożywką hodowlaną.
- W dniu 4 zebrać supernatant do probówki o pojemności 15 ml i wirować przez 5 minut przy 500 x g, aby usunąć martwe komórki i zanieczyszczenia. Dalej oczyść supernatant, przepuszczając go przez filtr 0,45 μm za pomocą dużej strzykawki o pojemności 60 ml. Natychmiast rozlać do jednorazowych porcji (300 μl) i przechowywać w temperaturze -80 °C. Aby utrzymać maksymalną aktywność produktu, unikaj cyklu zamrażania i rozmrażania.
2. Transdukcja lentiwirusowa
- Podziel linię komórkową, która ma być zakażona przy 60% zbieganiu (komórki HEK-293 i SH-SY5Y; 5 x 10⁵ komórek na dołek i U2OS; 1 x 10⁵ komórek na dołek) na 6-dołkowej płytce do hodowli tkankowej w 2 ml pożywki DMEM uzupełnionej 10% FBS.
- Przechowywać przez noc 6-dołkową płytkę do hodowli tkankowej w inkubatorze o temperaturze 37 °C w temperaturze 5% CO₂.
- Wyjąć zamrożonego lentiwirusa z zamrażarki w temperaturze -80 °C i rozmrozić porcję na lodzie przed każdym użyciem; nie zamrażać ponownie.
- Podczas rozmrażania wirusa należy ogrzać pożywkę do hodowli komórkowej zawierającą surowicę zgodną z linią komórkową będącą przedmiotem zainteresowania. Po całkowitym rozmrożeniu wirusa przygotuj szereg rozcieńczeń (1:3, 1:10, 1:30 i 1:100) w DMEM w świeżej probówce do mikrofuge o pojemności 1,5 ml.
- Zwiększyć objętość w probówkach do 1 ml za pomocą zredukowanej pożywki surowicy.
- Dodać 2 μl polibrenu (w zapasie 4 μg/μl) do 1 ml wirusa/pożywki. Dobrze wymieszać pipetując i dodać 1 ml mieszaniny do komórek. Inkubować komórki z wirusem przez 24 godziny.
- Usuń nośnik wirusa i zastąp go zwykłym nośnikiem DMEM uzupełnionym 10% FBS. Utrzymuj ogniwa w temperaturze 37 °C, 5% CO₂.
- Monitoruj wzrost komórek i zmieniaj pożywkę hodowlaną co dwa dni. Przy zbieganiu rozszerz 6-dołkową półkę na płytkę do hodowli tkankowej o średnicy 10 cm.
- Gdy komórki zostaną wystarczająco rozprężone, wysiewaj 1,5 x 10⁴ komórki na studzienkę w 50 μl pożywki DMEM na 384-dołkowych płytkach testowych, aby sprawdzić poziom ekspresji białka znakowanego YFP za pomocą mikroskopii. Jeśli ekspresja komórki białkowej znakowanej YFP wykazuje stosunek sygnału do szumu ≥3, przygotuj zapas komórek dla odpowiedniej linii komórkowej.
3. Zależny od czasu wpływ inhibitora proteasomu na agregację białek
UWAGA: Wykonaj akwizycję obrazu za pomocą automatycznego mikroskopu (zobacz Materiały).
- Dozuj 0,25 μl DMSO lub inhibitora proteasomu rozpuszczonego w 100% DMSO (ALLN, 2 mM) na 384-dołkowe płytki o płaskim dnie.
- Ręcznie wysiewać 1,5 x 104 komórek na studzienkę w 50 μl pożywki DMEM na tej samej płytce testowej. Końcowe stężenie inhibitora proteasomu (ALLN) powinno wynosić 10 μM.
- Ustawić jednostkę kontroli środowiska systemu mikroskopu na 37 °C i 5% CO₂. Zrzut ekranu przedstawiający konfigurację eksperymentalną pokazano na rysunku 2.
- Mikroskop należy obsługiwać w trybie fluorescencji szerokokątnej, korzystając z oprogramowania z następującymi ustawieniami: obiektyw LWD 20X, tryb niekonfokalny, 4 pola/studzienkę, z godzinnym interwałem rejestrowania. Na końcu każdego uruchomienia przechwycone obrazy są automatycznie przesyłane na serwer.
4. Obrazowanie poklatkowe dla ekspresji YFP w żywych komórkach i analiza obrazu (pojedynczy kanał)
UWAGA: Poniższe kroki opisują zastosowanie oprogramowania (np. Columbus).
- Wybierz odpowiedni algorytm do segmentacji obiektów podstawowych (cytozolu i agregatów). W razie potrzeby dostosuj próg tła i parametry kontrastu (Rysunek 3).
- Policz komórki za pomocą funkcji "znajdź komórki" z indywidualnym progiem 0,1 dla kanału intensywności YFP. Określ wartości zagregowane za pomocą algorytmu "znajdź plamki" ze względną intensywnością plamki YFP >0,2 i współczynnikiem podziału 1,0.
5. Wpływ inhibitorów proteasomu na agregację białek na żywych komórkach barwionych na ich jądra (dwa kanały)
UWAGA: Wykonaj akwizycję obrazu za pomocą automatycznego mikroskopu. Określ zakres stężeń inhibitorów proteasomu (ALLN, epoksomycyna i MG132) w oparciu o oczekiwaną wartość IC50, aby zapewnić optymalne dopasowanie krzywej.
- Przygotować seryjne rozcieńczenia związków na 384-dołkowej płytce polipropylenowej do przechowywania według standardowej serii rozcieńczeń 1:3. Upewnij się, że dobrze wymieszałeś rozcieńczenia związków, aby upewnić się, że stężenia związków są dokładne.
- Dozować 0,25 μl inhibitorów proteasomu na puste, płaskie, czarne 384-dołkowe płytki testowe. Używamy maszyny do obsługi cieczy wyposażonej w głowicę kapilarną 384 zdolną do przenoszenia objętości.
- Wysiewaj 1,5 x 1010⁴ komórek na studzienkę w 50 μl pożywki DMEM na płytkach testowych. Inkubować płytki testowe w temperaturze 37 °C i 5% CO₂ przez 24 godziny.
- Dodać 10 μl pożywki DMEM (wstępnie podgrzanej w temperaturze 37 °C) z roztworem barwiącym (Hoechst 33342 przy zapasie 10 mg/ml) i inkubować w temperaturze pokojowej przez 10 minut.
- Uruchom oprogramowanie operacyjne mikroskopu. Zrzut ekranu przedstawiający konfigurację eksperymentalną pokazano na rysunku 4. Wybierz zakładkę "Konfiguracja" i wybierz obiektyw 20X oraz odpowiedni typ płytki. Upewnij się, że "kołnierz" jest ustawiony na odpowiednią wartość na obiektywie, co pozwala na prawidłowe ustawienie ostrości przy różnych typach płytek.
- Wybierz zakładkę "Mikroskop". Zdefiniuj ekspozycję 1 jako YFP (laser 488), a ekspozycję 2 jako Hoechst (laser 405). Aktywuj filtr dla obu ekspozycji i przypisz ekspozycję 1 do kamery 1 i ekspozycję 2 do kamery 2. Ustaw czasy naświetlania na ~800 ms dla ekspozycji 1 i ~40 ms dla ekspozycji 2.
- Wybierz ekspozycję 1. Ustaw wysokość ostrości na 0 μm. Wybierz "Ostrość". Po ustawieniu ostrości naświetl aparat 1. Dostosuj wysokość ostrości, aby zoptymalizować płaszczyznę ekspozycji i kliknij "Weź wysokość". Zmień czasy naświetlania i moc lasera, aby uzyskać maksymalną intensywność pikseli ~3,000. Zapisz parametry ekspozycji. Powtórz te czynności dla ekspozycji 2.
- Wybierz kartę "Definicja eksperymentu". Utwórz układ i układ podrzędny. Przeciągnij i upuść odpowiedni układ, ekspozycję, obraz referencyjny, plik pochylenia i podukład. Zapisz eksperyment.
- Wybierz zakładkę "Automatyczny eksperyment" i uzyskaj obrazy. Na końcu każdego uruchomienia przechwycone obrazy są automatycznie przesyłane na serwer.
6. Analiza obrazu dwóch kanałów
- Wybierz algorytm oprogramowania do segmentacji obiektów podstawowych (jąder, cytozolu i agregatów) (rysunek 5).
- Wybierz metodę, która dokładnie segmentuje jądra poprzez oględziny segmentowanych obiektów. Obiekty barwione metodą Hoechsta w kanale 1 (Ch1) zostaną użyte do określenia liczby komórek. Barwienie YFP ze zmutowanego SOD1-A4V w kanale 2 (Ch2) zostanie wykorzystane do określenia ilości agregatów.
- Policz komórki za pomocą algorytmu "znajdź jądra" jako obszary barwienia Hoechsta >20 μm², ze współczynnikiem podziału 7,0, indywidualnym progiem 0,40 i kontrastem >0,10.
- Utwórz tabelę danych i określ EC50 dla każdego ze związków, korzystając z równania "Regresja nieliniowa" w oprogramowaniu do tworzenia wykresów.
