Wszystkie procedury z udziałem ludzi zostały przeprowadzone zgodnie z instytucjonalnymi, krajowymi i międzynarodowymi wytycznymi dotyczącymi dobra ludzi i zostały sprawdzone przez lokalną komisję rewizyjną instytucji.
1. Test aktywności endotoksyn (EAA)
- Próbki krwi pacjenta należy pobrać w sterylnych probówkach zawierających antykoagulant EDTA. Przechowuj próbki krwi w temperaturze pokojowej
- Przygotuj probówki EA dla każdej próbki krwi pacjenta, którą chcesz przebadać. Umieść probówki w stojakach na tuby. Następnie zdejmij nakrętki.
- Każdy test EA składa się z 5 różnych rodzajów probówek; użyj każdej z nich do innej części testu (patrz następne kroki).
- Użyj probówki #1 (probówka "kontrolna") do pomiaru podstawowej aktywności niespecyficznego wybuchu oksydacyjnego neutrofili pacjenta przy braku swoistego przeciwciała.
- Użyj probówki #2 (probówka "Próbka") do pomiaru wybuchu oksydacyjnego w odpowiedzi na kompleks lipopolisacharydów (LPS) i przeciwciał
.
- Użyj probówki #3 (rurka "Max") do zmierzenia maksymalnego wybuchu oksydacyjnego neutrofili pacjenta w odpowiedzi na nadmiar endotoksyny.
- Użyj rurki #4 (rurki "LPS") jako źródła egzogennej endotoksyny.
- Użyj probówki #5 (tubka "Podwielokrotna") do przechowywania krwi.
UWAGA: Duplikaty probówek #1, #2 i #3 są dostarczane dla łącznie 8 probówek, które należy użyć do każdej badanej próbki krwi (butelka z odczynnikiem EA i test kontroli jakości mogą być używane do wszystkich testów zawartych w woreczku).
- Za pomocą pipety dwufunkcyjnej odpipetuj 1 ml objętości odczynnika EA z butelki do probówek #1 (probówka kontrolna), #2 (probówka z próbką) i #3 (probówka Max), z których każda jest w dwóch egzemplarzach.
UWAGA: Odpipetuj bok probówki, aby uniknąć ponownego rozpryskiwania się roztworu.
- Wymieszaj próbkę krwi pacjenta, delikatnie odwracając probówkę do pobierania krwi 20 razy. Następnie odpipetować 0,5 ml krwi pacjenta do probówki #4 (probówka LPS max) i probówki #5 (probówka z podwielokrotnością). Rurka wirowa #4 przez 10 s.
- Umieść stojaki na probówki ze wszystkimi probówkami EA w wytrząsarce inkubatora. Zamknąć pokrywkę i inkubować przez 10 minut w temperaturze 37°C.
- Otwórz pokrywę i wyjmij stojaki na probówki z wytrząsarki inkubatora. Rurka wirowa #5 (rurka podwielokrotna). Za pomocą sterylnej końcówki odpipetować 40 μl krwi do probówek #1 i #2, po kolei.
- Rurka wirowa #4 (rura LPS). Używając tej samej końcówki do pipety, odpipetuj 40 μl krwi z probówki #4 do probówki #3 (probówka Max), w dwóch egzemplarzach.
- Wiruj sześć końcowych probówek (#1, #2, #3 i odpowiednie duplikaty), a następnie umieść je z powrotem w stojakach.
UWAGA: Upewnij się, że wszystkie rurki są wirowane przez ten sam czas.
- Włóż stojaki na probówki z powrotem do wytrząsarki inkubacyjnej i zamknij pokrywę. Ustaw wytrząsarkę inkubacyjną na 100 obr./min, a następnie rozpocznij ruch na 14 minut.
- Włóż kartę chipową z oznaczeniem EA do chemiluminometru i naciśnij start. Po 14 minutowej inkubacji postępuj zgodnie z instrukcjami wyświetlanymi na chemiluminometrze, aby odczytać probówki EA we właściwej kolejności.
- Delikatnie wirować każdą probówkę przez 10 s przed umieszczeniem jej na uchwycie próbki chemiluminometru. Otwórz szufladę na próbkę i umieść rurkę #1 w uchwycie na próbkę. Następnie zamknij szufladę na próbki i poczekaj na odczyt względnej jednostki światła (RLU).
- Powtórz krok 1.12 dla rurki 2 i rurki 3.
- Powtórz krok 1.12 dla zduplikowanych probówek 1, 2 i 3.
nuta: Spróbuj wirować wszystkie rurki przez ten sam czas w krokach 1.12–1.14.
- Po przetworzeniu wszystkich probówek należy pamiętać, że wyniki EA zostaną obliczone i wydrukowane automatycznie. Poziomy są wyrażone w jednostkach EA i reprezentują średnią z podwójnych oznaczeń z tych samych próbek.
- Powtórz kroki od 1.4 do 1.15 dla każdej próbki krwi, która musi zostać przetestowana.
- Po zakończeniu testu należy przechowywać pozostałe probówki i odczynniki EA w temperaturze 2–8 °C przez okres do 30 dni.