$$\rightleftharpoonup{xx}$$
$$\longleftharp{xx}$$,
$$\longrightharp{xx}$$,
1. Aktywacja płytki zestawu testowego
- Aktywować 96-dołkową płytkę zestawu testowego filtra (zawierającego niebieski CPH-ksylan) (wykaz materiałów) poprzez dodanie 200 μl roztworu aktywacyjnego (otrzymanego z zestawem) do każdej studzienki, a następnie 10-minutową inkubację w temperaturze pokojowej bez mieszania.
- Zastosować podciśnienie za pomocą kolektora próżniowego (z blokiem dystansowym wewnątrz i dowolną standardową, przezroczystą 96-dołkową płytką jako płytką zbiorczą) w celu usunięcia istniejącego roztworu aktywacyjnego. Na tym etapie można również użyć wirówki o stężeniu 2 700 x g przez 10 minut zamiast kolektora próżniowego.
- Umyj podłoża CPH, dodając 100 μl sterylnej wody i zastosuj podciśnienie (lub siłę odśrodkową) w celu usunięcia stabilizatora. Powtórz ten krok jeszcze dwa razy, a płytki będą teraz gotowe do użycia.
2. Reakcja enzymatyczna
UWAGA: Zawsze dołączaj sam bufor jako kontrolę negatywną, a jeśli to możliwe, wcześniej scharakteryzowane enzymy jako kontrole pozytywne. Należy użyć statystycznie odpowiedniej liczby powtórzeń. Substraty CPH są stabilne w zakresie pH od 3,0 do 10,0, a całkowita objętość roztworu enzymatycznego na końcu buforu w każdym dołku nie powinna przekraczać 180 μl. Zamiast oczyszczonego roztworu enzymatycznego można również użyć ekstraktu roślinnego lub bulionu kulturowego.
- Dodać 150 μl 100 mM buforu octanu sodu o pH 4,5 i 5 μl roztworu endocelulazy (do końcowego stężenia 1 U/ml) do każdego dołka płytki zestawu do oznaczania.
- Umieść płytkę produktu (płytkę z przezroczystym dołkiem kompatybilną z czytnikiem płytek do mikromiareczkowania) pod płytką zestawu do testów, aby zebrać wszelkie potencjalne wycieki z płytki reakcyjnej podczas wytrząsania.
- Inkubować płytkę zestawu do oznaczania w temperaturze 25 °C przez 30 minut w wytrząsarce poziomej z prędkością 150 obr./min.
UWAGA: Mieszanie reakcji na płytce zestawu do oznaczania podczas inkubacji ma kluczowe znaczenie dla uzyskania spójnego i powtarzalnego wyniku. Podłoża CPH są stabilne w temperaturze do 90 °C. Czas inkubacji należy wydłużyć do 24 godzin w przypadku badania bulionów hodowlanych zawierających nieznane stężenia enzymów z substratami CPH. Należy pamiętać, że odpowiednie czasy inkubacji zależą od aktywności enzymu (enzymów), ale ogólnie rzecz biorąc, jeśli nie ma wykrywalnej aktywności w ciągu 24 godzin, jest prawdopodobne, że enzym nie zdegraduje badanego substratu. Aktywny enzym rozkłada nierozpuszczalne chromogenne polisacharydy substratu CPH do rozpuszczalnych chromogennych oligosacharydów, które są widoczne jako kolorowy supernatant.
- Umieść czystą płytę produktu wewnątrz kolektora próżniowego z blokiem dystansowym w środku.
- Umieścić płytkę zestawu testowego na wierzchu i zastosować podciśnienie (maksymalne podciśnienie -60 kPa). Możliwe jest również użycie wirówki o stężeniu 2 700 x g przez 10 min.
UWAGA: Przesącz zawierający barwione oligosacharydy jako produkt reakcji znajduje się teraz na płytce produktu w celu dalszej analizy.
3. Wykrywanie i kwantyfikacja
- Sprawdź, czy objętość cieczy w każdej studzience na płycie produktu jest w przybliżeniu taka sama poprzez oględziny.
- Odczytać absorbancję płytki zbiorczej przy długości fali 595 nm dla niebieskiego CPH-ksylanu za pomocą czytnika płytek.
- Przeprowadzając analizę danych, należy odjąć wartości kontroli ujemnej tylko w buforze od wartości z dołków, w których dodano enzym. Obliczyć wartość średnią i błąd standardowy średnich (SEM) z dołków replik.