1. Test chromogeniczny z substratami ICB w formacie 96-dołkowym
- Reakcja enzymatyczna
- Dodać 150 μl 100 mM buforu octanu sodu o pH 4,5 i 5 μl 31 U/ml roztworu endo-ksylanazy do każdego dołka na płytce zestawu do oznaczania zawierającej czerwoną słomę pszenną ICB (końcowe stężenie enzymu w studzience: 1 U/ml).
nuta: Płytki zestawu testowego (96-dołkowe płytki filtracyjne zawierające substraty ICB) są produkowane zgodnie z opisem w literaturze (patrz Wykaz materiałów). Substraty ICB są stabilne w o pH w zakresie od 3,0 do 10,0. Zawsze należy uwzględnić sam bufor jako kontrolę ujemną, enzymy handlowe jako kontrolę pozytywną i użyć statystycznie odpowiedniej liczby replik.
- Nie aktywuj substratów ICB, takich jak płytka substratu CPH, ale usuń stabilizator, przemywając trzykrotnie 100 μl wody, a następnie filtrując próżniowo lub odwirowując.
- Umieść płytkę produktu pod płytą podłoża, aby zebrać potencjalny wyciek z płyty podłoża podczas wytrząsania.
- Inkubować reakcję w temperaturze 25 °C, wytrząsając z prędkością 150 obr./min przez 2 godz.
nuta: Aktywny enzym rozkłada nierozpuszczalne chromogenne polisacharydy w podłożu ICB do rozpuszczalnych oligosacharydów, które są widoczne jako kolorowy supernatant. Podłoża ICB są stabilne w temperaturze do 90 °C. Czas inkubacji należy wydłużyć do 24 godzin, jeśli stosuje się nieoczyszczone enzymy, takie jak buliony hodowlane.
- Umieść płytkę produktu wewnątrz kolektora próżniowego z blokiem dystansowym w środku.
- Umieścić płytkę zestawu do oznaczania na wierzchu i zastosować podciśnienie (maksymalne podciśnienie -60 kPa) lub użyć wirówki, aby przefiltrować produkt z płytki zestawu do oznaczania do dołka płytki produktu.
nuta: Przesącz zawierający barwne oligosacharydy jako produkt reakcji znajduje się teraz na płytce zbiorczej w celu dalszej analizy.
2. Wykrywanie i kwantyfikacja
- Sprawdź, czy objętość cieczy w każdej studzience płytki zbiorczej jest w przybliżeniu taka sama, przeprowadzając oględziny.
- Odczytać absorbancję płytki zbiorczej przy długości fali 517 nm dla czerwonej słomy pszennej ICB za pomocą czytnika płytek.
- Podczas przeprowadzania analizy danych – odejmij bufor – tylko wartości kontroli ujemnej od wartości z dołków, do których dodano enzym. Obliczyć wartość średnią i błąd standardowy średnich (SEM) z duplikowanych dołków.
nuta: W przypadku badań przesiewowych nieznanych enzymów sugerujemy wykonanie serii rozcieńczeń w celu uzyskania bardziej szczegółowych danych na temat dynamicznego zakresu aktywności enzymu.
