Różnicowy test barwienia jądrowego: Test mający na celu określenie cytotoksyczności mitokanu za pomocą jodku propidyny i podwójnego barwienia Hoechst

Streszczenie

Źródło: Pei, J. et al., Zautomatyzowany różnicowy test barwienia jądrowego do dokładnego oznaczania cytotoksyczności mitokanu. J. Vis. Exp. (2020)

Ten film demonstruje metodę barwienia jądrowego w celu wykrycia cytotoksycznego wpływu mitokanu na wrażliwe na leki komórki nowotworowe i zdrowe warianty. Podwójne barwienie barwnikami wiążącymi DNA, takimi jak jodek propidyny i barwnik Hoechsta, zapewnia wyraźne rozróżnienie między martwymi i żywymi komórkami, pomagając w ten sposób ocenić cytotoksyczność leku.

Protokół

1. Test cytotoksyczności: Konfiguracja

1. Przygotuj roztwory interesujących Cię związków w pożądanych stężeniach w odpowiednich pożywkach (bez surowicy lub 1, 2,5 lub 5% FBS RPMI-1640).
   1. Aby zmierzyć cytotoksyczność pojedynczego związku (np. w celu określenia skutecznych dawek), należy przygotować związki o 2-krotnym stężeniu końcowym.
   2. Aby zmierzyć cytotoksyczność kombinacji związków, należy przygotować związki o 4-krotnym stężeniu końcowym.
   3. Przygotować kontrole zawierające tylko rozpuszczalnik, mieszając tę samą ilość rozpuszczalnika z odpowiednim podłożem. Na przykład, jeśli bada się związki rozpuszczone w DMSO i metanolu, n....

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
2-Deoksy-D-glukoza/2-DG	Chem-Impex	50-519-067
3-bromopirogronian	Alfa Aesar	Numer katalogowy: 1113-59-3
Płytki 96-dołkowe	Greiner Bio-One	Numer katalogowy: 655090	Czarne lub przezroczyste płaskodenne płytki 96-dołkowe
Hrabina II automatyczny licznik komórek	Rybak termiczny
Cytation 5 Czytnik wielotrybowy obrazowania komórek	BioTek
Hoechst 33342	Rybak termiczny	Numer katalogowy: 62249	20 mM roztwór; stężenie końcowe 1:1 000
HyClone płodowa surowica bydlęca	GE Opieka zdrowotna	#25-514
m-chlorofenylohydrazon/CCCP	Sigma Aldrich	Zobacz materiał C2759
Tabletki PBS	Rybak termiczny	BP2944100	1 tabletka + 200 ml sterylnej wody = 1x roztwór PBS
Penicylina-Streptomycyna-Glutamina (100X)	Gibco (firma Gibco)	10378016
Jodek propidyny	Rybak termiczny	50-596-072	Suchy proszek; zapas 1 mg/ml w PBS; stężenie końcowe 5 μg/ml (komórki białaczkowe), 1 μg/ml (normalne PBMC)
Rotenon	Ark Pharm	AK115691
RPMI-1640 Pożywka z L-glutaminą i wodorowęglanem sodu, płynna, sterylnie filtrowana, odpowiednia do hodowli komórkowych	Sigma Aldrich	Czynnik chłodniczy R8758-500ML
Niebieska plama trypanowa (0,4%)	Gibco (firma Gibco)	Numer katalogowy: 15250-061
Linie komórkowe
Zobacz materiał K562	Kontroler ATCC (Kontroler T	Zobacz materiał CCL-243	Linia komórkowa CML
MOLM-13	Kontroler ATCC (Kontroler T		Linia komórkowa AML
MOLT-4	Kontroler ATCC (Kontroler T	CRL-1582	Linia komórkowa ALL
OCI-AML2	Kontroler ATCC (Kontroler T		Linia komórkowa AML

powiedział: powiedział: