1. Test cytotoksyczności: Konfiguracja
- Przygotuj roztwory interesujących Cię związków w pożądanych stężeniach w odpowiednich pożywkach (bez surowicy lub 1, 2,5 lub 5% FBS RPMI-1640).
- Aby zmierzyć cytotoksyczność pojedynczego związku (np. w celu określenia skutecznych dawek), należy przygotować związki o 2-krotnym stężeniu końcowym.
- Aby zmierzyć cytotoksyczność kombinacji związków, należy przygotować związki o 4-krotnym stężeniu końcowym.
- Przygotować kontrole zawierające tylko rozpuszczalnik, mieszając tę samą ilość rozpuszczalnika z odpowiednim podłożem. Na przykład, jeśli bada się związki rozpuszczone w DMSO i metanolu, należy przeprowadzić kontrolę tylko z rozpuszczalnikiem dla każdego rozpuszczalnika.
- Zebrać komórki z naczynia hodowlanego lub kolby do stożkowej probówki o pojemności 15 ml.
- Przenieść 10 μl zawiesiny komórkowej do probówki mikrowirówkowej i zabarwić 10 μl 0,4% błękitu trypanowego. Użyj hemocytometru, aby policzyć żywotne i nieżywotne komórki dla każdego źródła komórek.
- Komórki osadu po 200 g przez 5 min. Aspirat lub dekantacja supernatantu.
- Zawiesić osad komórkowy w pożywce odpowiedniej do testu (bez surowicy lub 1, 2,5, 5% FBS RPMI-1640) przy gęstości komórek 3*105 komórek/ml.
UWAGA 1: Gęstość komórek 3 * 105 komórek / ml zapewnia gęstość wysiewu 15 000 komórek / studzienkę. Gęstość wysiewu jest ważnym parametrem i najlepiej byłoby, gdyby została wstępnie zdefiniowana przed eksperymentem. Gęstość wysiewu powinna uwzględniać: 1) wielkość komórek – zwykle większe komórki wysiewa się przy mniejszej gęstości; 2) czas trwania leczenia – komórki są zazwyczaj wysiewane o mniejszej gęstości w eksperymentach, które będą trwać dłużej, oraz 3) szybkość podziału komórek – komórki o wyższym współczynniku podziału są wysiewane o mniejszej gęstości. Konkretne przykłady zoptymalizowanych gęstości wysiewu: komórki K562, większe, czas trwania 24 godziny – 10 000 komórek/dołek; Komórki MOLM-13, umiarkowanej wielkości, zabieg 24 h – 15 000/studnię; Komórki MOLM-13, 48 godzin leczenia – 8 000/studzienkę; małe zdrowe komórki jednojądrzaste krwi obwodowej (PBMC), leczenie 24 godziny – 50 000/studnię; pierwotne komórki AML, leczenie 24 h – 15 000-20 000 / dobrze.
UWAGA 2: Obecność FBS w pożywkach może wpływać na aktywność związków. Zmniejszenie stężenia FBS może ułatwić interpretację wyników testu, ale także zmniejszyć dokładność fizjologiczną.
- Wysiać 50 μl zawiesiny komórkowej z etapu 1.5 do każdego dołka 96-dołkowej płytki za pomocą pipety wielokanałowej.
- Dodaj związki w następujący sposób:
- W przypadku testów jednoskładnikowych dodaj 50 μl 2x roztworu złożonego do każdej studzienki. W przypadku studzienek kontrolnych rozpuszczalników dodać 50 μl pożywki testowej zawierającej rozpuszczalnik o stężeniu 2x.
- W przypadku testów łączonych dodać 25 μl każdego ze związków (4x roztwory) do każdego dołka. W przypadku pojedynczych studzienek kontrolnych dodać 25 μl 4x roztworu związku i 25 μl pożywki testowej. W przypadku studzienek kontrolnych rozpuszczalnika dodać 50 μl pożywki testowej lub pożywki testowej zawierającej rozpuszczalnik.
UWAGA 1: Końcowe stężenie DMSO nie powinno przekraczać 0,5%.
UWAGA 2: Zaleca się dodawanie pożywki zawierającej związki pipetą dotykającą ścianki każdej studzienki ze względu na małą objętość.
- Delikatnie postukaj w płytkę, aby upewnić się, że zawartość studzienek się wymieszała.
- Inkubować płytki w temperaturze 37 °C w wilgotnej atmosferze 5% CO2 przez odpowiedni czas, np. 24 godziny.
2. Test cytotoksyczności: barwienie za pomocą Hoechst 33342 i jodku propidyny
- Przygotuj 10x roztwór barwiący. Roztwór ten należy przygotować na świeżo przed każdym eksperymentem, nie można go przechowywać. Końcowe stężenia barwnika powinny być określone przed eksperymentem.
- W przypadku linii komórkowych białaczki i komórek białaczki pierwotnej 1 ml 10-krotnego buforu barwiącego zawiera 10 μl 20 mM Hoechst 33342 i 50 μl 1 mg/ml jodku propidyny w sterylnym PBS (stężenia końcowe: Hoechst 33342 20 μM, PI 5 μg/ml).
- Dla zdrowych PBMC 1 ml 10x buforu barwiącego zawiera 10 μl 20 mM Hoechst 33342 i 10 μl 1 mg/ml jodku propidyny w sterylnym PBS (końcowe stężenia: Hoechst 33342 20 μM, PI 1 μg/mL).
nuta: Końcowe stężenie jodku propidyny musi zostać określone przed rozpoczęciem doświadczeń. Komórki powinny być badane przy użyciu zakresu stężeń PI (1, 2,5, 5 μg/ml), a następnie żywotność obliczoną przez Hoechst/PI należy porównać z żywotnością mierzoną za pomocą błękitu trypanowego. Wymienione powyżej stężenia PI zostały wybrane na podstawie żywotności komórek docelowych w studzienkach kontrolnych (powyżej ~90% dla linii komórkowych białaczki, powyżej ~70% dla zdrowych PBMC).
ostrożność: Hoechst 33342 i jodek propidyny są potencjalnymi substancjami rakotwórczymi. Podczas obchodzenia się z nimi należy nosić odpowiednie środki ochrony osobistej.
- Po inkubacji użyj pipety wielokanałowej, aby dodać 10 μl 10x buforu barwiącego do każdej studzienki.
nuta: Aby zapobiec zanieczyszczeniu krzyżowemu, upewnij się, że końcówki pipet nie dotykają nośnika.
- Delikatnie postukaj w talerz, aby wymieszać i usunąć bąbelki. Bejcować w temperaturze 37 °C przez 15 min.
- Odwirować płytkę o masie 200 g przez 4 minuty, aby wszystkie komórki znalazły się na dnie płytki. Ostrożnie przetrzyj spód płytki wilgotną chusteczką kimwipe w celu usunięcia włókien i/lub zanieczyszczeń, które będą zakłócać obrazowanie.
UWAGA 1: Odwirowanie płytki zapewnia największe szanse na uchwycenie wszystkich komórek na obrazie. Często martwe komórki odrywają się i unoszą na wodzie, dostarczając mylących wartości cytotoksyczności. Wirowanie łagodzi ten efekt.
UWAGA 2: Płytkę należy zobrazować tak szybko, jak to możliwe po odwirowaniu, najlepiej w ciągu 15 minut. Wirowanie może zmniejszyć selektywność barwienia PI i może pozwolić komórkom na powolne gromadzenie jodku propidyny. Poprawa dokładności uzyskana dzięki wizualizacji martwych komórek przeważa nad niewielkim wzrostem barwienia PI
