Test wiązania aneksyny V: technika oparta na fluorescencji do identyfikacji erytrocytów apoptotycznych poprzez znakowanie fosfatydyloseryną

Abstract

Źródło: Bigdelou, P., et al. Indukcja eryptozy w czerwonych krwinkach za pomocą jonoforu wapnia. J. Vis. Exp. (2020)

W tym filmie pokazujemy test wiązania Aneksyny V do pomiaru stopnia eryptozy, zaprogramowanej śmierci komórki erytrocytów, za pomocą barwienia fluorescencyjnego Aneksyny V. Erytrocyty apoptotyczne wykazują translokację fosfatydyloseryny z wewnętrznej do zewnętrznej płatki błony komórkowej, powodując wiązanie się znakowanej fluoroforem aneksyny V z translokowaną fosfatydyloseryną, emitując w ten sposób sygnał fluorescencyjny.

Protocol

Wszystkie procedury z udziałem ludzi zostały przeprowadzone zgodnie z instytucjonalnymi, krajowymi i międzynarodowymi wytycznymi dotyczącymi dobrobytu ludzi i zostały sprawdzone przez lokalną komisję rewizyjną instytucji.

1. Test wiążący załącznika-V

1. Rozpuścić 1 mg soli wapniowej jonomycyny w 630 μl dimetylosulfotlenku (DMSO) do osiągnięcia końcowego stężenia 2 mM. Podwielokrotność porcji i przechowywać w temperaturze -20 °C.
2. Pobrać 1 ml 0,4% hematokrytu i dodać 0,5 μl 2 mM jonomycyny, aby osiągnąć końcowe stężenie 1 μM. Inkubować przez 2 godziny w temperaturze 37 °C.
3. Odwirować hematokryty poddane działaniu j....

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Annexin V Alexa Fluor 488 - zestaw do apoptozy	Fisher Naukowy	A10788	Przechowywać w temperaturze 4 °C
Cytometr przepływowy BD FACSAria II	BD Nauki biologiczne	643177
Sól wapniowa jonomycyny	EMD Milipore Corp.	407952-1MG	Rozpuścić w DMSO, aby osiągnąć 2 mM. Przechowywać w temperaturze -20 °C
wirówka	Millipore Sigma	Zobacz materiał M7157	modelu Eppendorf 5415C
Jednorazowa rurka do cytometrii przepływowej z okrągłym dnem	Firma VWR	VWRU47729-566
CaCl2	Fisher Naukowy	Zobacz materiał C79-500
DPBS (Polskie Biuro Obsługi	VWR Nauki przyrodnicze	SH30028.02
Probówka do mikrowirówek	Fisher Naukowy	02-681-5
Krew pełna w ACD	Zen-Bio		Przechowywać w temperaturze 4 °C i ogrzać do 37 °C przed użyciem