$$\rightleftharpoonup{xx}$$
$$\longleftharp{xx}$$,
$$\longrightharp{xx}$$,
Wszystkie procedury z udziałem ludzi zostały przeprowadzone zgodnie z instytucjonalnymi, krajowymi i międzynarodowymi wytycznymi dotyczącymi dobrobytu ludzi i zostały sprawdzone przez lokalną komisję rewizyjną instytucji.
1. Test wiążący załącznika-V
- Rozpuścić 1 mg soli wapniowej jonomycyny w 630 μl dimetylosulfotlenku (DMSO) do osiągnięcia końcowego stężenia 2 mM. Podwielokrotność porcji i przechowywać w temperaturze -20 °C.
- Pobrać 1 ml 0,4% hematokrytu i dodać 0,5 μl 2 mM jonomycyny, aby osiągnąć końcowe stężenie 1 μM. Inkubować przez 2 godziny w temperaturze 37 °C.
- Odwirować hematokryty poddane działaniu jonomycyny i niepoddane działaniu jonomycyny przy 700 x g przez 5 minut w temperaturze pokojowej i usunąć ich supernatanty, aby pozostawić osady komórkowe na dnie probówek.
- Przemyć komórki 3x roztworem Ringera, zawieszając granulki komórek w 1,5 ml roztworu Ringera, odwirowując przy 700 x g przez 5 minut w temperaturze pokojowej i odrzucając supernatanty.
- Zawiesić granulki komórek erytrocytów traktowane jonomycyną i nieleczone w 1 ml buforu wiążącego 1x.
- Rozcieńczyć 2 ml buforu wiążącego 5x aneksyna V w 8 ml soli fizjologicznej buforowanej fosforanami (PBS) w celu uzyskania 1x buforu wiążącego.
- Pobrać 235 μl zawiesin komórkowych w buforze wiążącym i dodać 15 μl koniugatu Annexin V-Alexa Flour 488.
- Inkubować komórki w temperaturze pokojowej (RT) przez 20 minut w ciemnym miejscu. Wirować przy 700 x g przez 5 minut w temperaturze pokojowej i usunąć supernatant.
- Przemyć komórki 2x 1x buforem wiążącym, zawieszając osad komórkowy w 1,5 ml buforu wiążącego, odwirowując przy 700 x g przez 5 minut w temperaturze pokojowej i usuwając supernatant.
- Zawiesić osady komórkowe w 250 μl 1x buforu wiążącego do pomiarów cytometrii przepływowej.
2. Cytometria przepływowa
- Przenieść 200 μl erytrocytów barwionych anektyną w kształcie litery V do 1 ml okrągłodennych probówek polistyrenowych zgodnych z cytometrią przepływową.
- Zaloguj się do oprogramowania do cytometrii przepływowej i kliknij przycisk nowego eksperymentu. Kliknij przycisk nowej tuby. Wybierz arkusz globalny i wybierz zastosuj analizę, aby zmierzyć intensywność fluorescencji o długości fali wzbudzenia 488 nm i długości fali emisji 530 nm.
- Ustaw liczbę komórek na 20 000, które mają zostać pobrane do analizy sortowania komórek aktywowanych fluorescencją (FACS).
- Wybierz żądaną tubę i kliknij przycisk ładowania. Kliknij przycisk nagrywania, aby uzyskać pomiary rozproszenia do przodu i do boku. Powtórzyć te czynności dla wszystkich próbek.
- Kliknij prawym przyciskiem myszy przycisk próbki i kliknij zastosuj analizę wsadową, aby wygenerować plik wynikowy.
- Kliknij prawym przyciskiem myszy przycisk próbki i kliknij generuj pliki FSC.