$$\rightleftharpoonup{xx}$$
$$\longleftharp{xx}$$,
$$\longrightharp{xx}$$,
UWAGA: Jako wygodny punkt odniesienia dla czytelników, poniższa metodologia opisuje specyficzne warunki hodowli i materiały wymagane do pomiaru biodostępności Fe z 20 próbek eksperymentalnych, plus wymagane kontrole jakości, w serii testu biologicznego. Zwiększanie liczby próbek powyżej tej pojemności nie jest zalecane ze względu na czas wymagany do przeprowadzenia różnych etapów hodowli komórkowej i trawienia in vitro w teście biologicznym.
1. Wybór ilości próbek
- W przypadku żywności stałej lub płynnej należy określić ilość żywności, którą można uznać za reprezentatywną dla badanej próbki.
- Do badania biodostępności Fe z odmiany fasoli należy użyć 100-150 g nasion fasoli i przetworzyć tę ilość na jednorodną próbkę.
- W przypadku próbek płynnych, takich jak wzbogacone soki, produkty mleczne i napoje dla sportowców, przed pobraniem próbek należy upewnić się, że żywność jest dobrze wymieszana.
UWAGA: Ilość materiału siewnego fasoli, o której mowa powyżej, jest niezbędna do uwzględnienia nieodłącznych różnic między nasionami tej podstawowej rośliny.
2. Przygotowanie próbek
- Przed przetwarzaniem spłucz glebę i kurz z każdej próbki żywności wodą destylowaną i dejonizowaną.
- Przetwarzaj odpowiednią ilość próbki zgodnie z celami doświadczalnymi, takimi jak metoda gotowania i mielenia.
UWAGA: Do gotowania i przetwarzania bardzo ważne jest, aby używać naczyń kuchennych i sprzętu, który nie jest potencjalnym źródłem zanieczyszczenia Fe. Sprzęt ze stali nierdzewnej nie zanieczyszcza; jednak urządzenia takie jak młynki kamienne, naczynia kuchenne z żeliwa i wszelkie urządzenia ze stali nierdzewnej zawierające Fe mogą dodawać znaczne ilości zanieczyszczenia Fe. Standardowy młynek do kawy ze stali nierdzewnej jest często wystarczający do mielenia.
- Liofilizować i zmielić na jednorodny proszek.
UWAGA: Badania wykazały, że po homogenizacji trzy niezależne powtórzenia analizy są odpowiednie dla każdego mierzonego pokarmu.
- Jeśli trudno jest osiągnąć jednorodność próbki, należy zmodyfikować formułę lub przetwarzanie produktu. Jeśli nie jest to możliwe, dodaj replikacje, jeśli niejednorodność nie jest poważna.
- W przypadku większości jednorodnych pokarmów stałych należy użyć 0,5 g liofilizowanej próbki na powtórzenie. W razie potrzeby należy użyć do 1,0 g próbki na powtórzenie, ale sprawdzić, czy więcej niż 0,5 g przynosi korzyści w zakresie stopnia reakcji.
UWAGA: Ilości większe niż 0,5 g pokarmów stałych mogą zatkać błonę dializacyjną (patrz poniżej).
- Użyj 1-2 ml próbek płynnych.
nuta: Liofilizacja często nie jest konieczna w przypadku próbek płynnych.
3. Hodowla komórkowa Caco-2
- Kultury podstawowe
- Kupuj ogniwa Caco-2 od certyfikowanego dostawcy.
- Hodować komórki z fiolek podstawowych w temperaturze 37 °C w inkubatorze z 5% atmosferą powietrza CO2 (stała wilgotność) przy użyciu zmodyfikowanego podłoża Eagle's Medium (DMEM) firmy Dulbecco uzupełnionego 25 mM HEPES (pH 7,2), 10% (v/v) płodowej surowicy bydlęcej (FBS) i 1% roztworu antybiotykowo-przeciwgrzybiczego.
- Gdy dostępna jest wystarczająca ilość komórek, zwykle po 7-10 dniach hodowli, należy wysiać komórki w kolbach niepokrytych kolagenem o gęstości 30 000 komórek/cm2.
- Wybierz rozmiar kolby w zależności od liczby komórek dostępnych i potrzebnych do wysiewu płytek wielodołkowych.
UWAGA: Ogólnie rzecz biorąc, kolby T225 (225 cm2) najlepiej sprawdzają się w eksperymentach, w których stosuje się 11 płytek wielodołkowych (6-dołkowych; 9,66 cm2 / dołek) (10 płytek do porównań próbek, 1 płytka do kontroli jakości) na test biologiczny.
- Hodować komórki w kolbach przez 7 dni, zmieniając podłoże co drugi dzień, a 7 dnia użyć do wysiewu płytek wielodołkowych.
UWAGA: Zaleca się stosowanie zakresu pasaży nie większego niż 10-15 pasaży od momentu rozpoczęcia hodowli komórek z hodowli podstawowej, a następnie wykorzystania w serii eksperymentów. Pasaże hodowli komórkowych powinny być ograniczone, ponieważ szeroki zakres pasaży może powodować zmiany adaptacyjne w linii komórkowej, a tym samym zmienność odpowiedzi modelu.
- Hodowla komórkowa na płytkach wielodołkowych
- Wysiewaj komórki Caco-2 o gęstości 50 000 komórek/cm2 w 6-dołkowych płytkach pokrytych kolagenem.
UWAGA: Ten krok zwykle działa najlepiej, jeśli jest wykonywany w środę. Poniższe kroki wyjaśnią, dlaczego ten dzień tygodnia jest optymalny.
- Hoduj komórki przez 12 dni w temperaturze 37 °C w inkubatorze z 5%CO2 atmosfery powietrza (stała wilgotność) przy użyciu DMEM uzupełnionego 25 mM HEPES (pH 7,2), 10% (v/v) FBS i 1% roztworem antybiotykowo-przeciwgrzybiczym.
UWAGA: Hodowla monowarstw komórkowych dłużej niż 12 dni może spowodować przerost komórek. Wcześniejsze badania wyraźnie wykazały, że w tych warunkach, po 12 dniach od wysiewu, monowarstwa komórkowa jest dojrzała, dobrze przylega do płytki i optymalna pod względem spójności odpowiedzi. Dłuższy wzrost komórek, na przykład do 19-21 dni, powoduje przerost komórek, a pożywka szybko wyczerpuje się w składniki odżywcze, co skutkuje niezdrowymi monowarstwami.
- W okresie 12 dni zmieniaj podłoże co najmniej co 2 dni zgodnie ze stałym harmonogramem dziennym.
- W 12 dniu po wysiewie zastąpić pożywkę hodowlaną 2 ml minimalnej pożywki niezbędnej (MEM [pH 7]) uzupełnionej 10 mM PIPES (kwas piperazyno-N,N'-bis-[2-etanosulfonowy]), 1% roztworem antybiotykowo-przeciwgrzybiczym, hydrokortyzonem (4 mg/l), insuliną (5 mg/l), selenem (5 μg/l), trójjodotyroniną (34 μg/l) i naskórkowym czynnikiem wzrostu (20 μg/l).
UWAGA: Jeśli rozsiewanie rozpoczęło się w środę, to 12 dniem byłby poniedziałek.
- Następnego dnia (tj. w dniu 13) należy usunąć MEM i zastąpić go 1 ml MEM (pH 7).
UWAGA: Ten krok miałby miejsce we wtorek. Jest to dzień, w którym rozpoczyna się test biologiczny; W ten sposób 13-dniowy harmonogram daje przewagę w postaci spójnego harmonogramu tygodniowego, co pozwala na konsekwentne przeprowadzanie testu biologicznego w tym samym dniu tygodnia.
4. Trawienie in vitro
- Przygotowanie pierścieni wsuwanych
- Utworzyć wysterylizowany pierścień wkładkowy za pomocą silikonowego pierścienia uszczelniającego o przekroju okrągłym wyposażonego w membranę do dializy przemytą kwasem (Rysunek 1A).
UWAGA: Przygotować wkładki 1 dzień wcześniej (tj. poniedziałek, 12 dnia) w dniu testu biologicznego i przechowywać w wodzie o stężeniu 18 MΩ o temperaturze 4 °C do momentu użycia.
- W dniu testu biologicznego (wtorek, dzień 13) wyjmij wkładki z lodówki, odcedź i zastąp wodę 0,5 M HCl. Pozostaw w temperaturze pokojowej w okapie z przepływem laminarnym na co najmniej 1 godzinę przed użyciem.
UWAGA: Ten krok należy wykonać przed usunięciem MEM z płytek hodowlanych. Mycie membrany kwasem służy do usunięcia ewentualnych zanieczyszczeń żelaza i sterylizacji pierścienia wkładki i membrany.
- Odcedź 0,5 M HCl z wkładek i spłucz sterylną wodą o mocy 18 MΩ. Przechowywać w sterylnej wodzie o temperaturze pokojowej 18 MΩ w okapie z przepływem laminarnym do momentu użycia.
- Włóż pierścień do każdej studzienki z 6-dołkowymi płytkami z komórkami Caco-2, tworząc w ten sposób system dwukomorowy. Włożyć płytki z wkładkami do inkubatora.
UWAGA: Ten krok należy wykonać zaraz po dodaniu świeżego 1,0 ml MEM do każdej studzienki (patrz Krok 3.2.5.).
- Przygotowanie roztworu pepsyny
- W dniu eksperymentu przygotuj roztwór pepsyny, rozpuszczając 0,145 g pepsyny w 50 ml 0,1 M HCl. Delikatnie wstrząsaj roztworem na wytrząsarce platformowej przez 30 minut w temperaturze pokojowej.
- Przygotowanie roztworu pankreatyny i żółci
- Tego samego dnia, w którym przeprowadzono eksperyment, przygotuj 0,1 MNaHCO3, rozpuszczając 2,1 gNaHCO3 w 250 ml wody o stężeniu 18 MΩ.
- Wymieszaj 0,35 g pankreatyny i 2,1 g ekstraktu żółciowego w 175 ml 0,1 M NaHCO3.
- Po rozpuszczeniu pankreatyny i ekstraktu żółciowego dodać 87,5 g słabej żywicy kationowymiennej (patrz tabela materiałów) i mieszać wstrząsając przez 30 minut w temperaturze pokojowej.
- Wlej gnojowicę do dużej kolumny i zbierz eluat.
- Eluować kolumnę za pomocą dodatkowych 70 ml 0,1 M NaHCO3, zbierając tę objętość do roztworu żółci pankreatyny.
UWAGA: Zadaniem żywicy jest usunięcie zanieczyszczenia Fe powszechnie występującego w ekstraktach z żółci pankreatyny.
- Rozpocznij trawienie in vitro.
- Odważyć próbkę w sterylnej probówce wirówkowej (polipropylenowej) o pojemności 50 ml, a następnie dodać 10 ml soli fizjologicznej o pH 2, zawierającej 140 mM NaCl i 5 mM KCl.
- Rozpocząć proces trawienia żołądkowego poprzez dodanie 0,5 ml przygotowanego roztworu pepsyny wieprzowej do próbki i inkubować na kołyszącym się wytrząsarce na małym, delikatnym ustawieniu przez 1 godzinę w temperaturze 37 °C.
- Po tym okresie należy rozpocząć proces trawienia jelitowego każdej próbki, dostosowując pH do 5,5-6,0 za pomocą 1,0 M NaHCO3.
- Dodać 2,5 ml roztworu żółci pankreatyny do każdej probówki z próbką i dostosować pH do 6,9-7,0 za pomocą 1,0 M NaHCO3.
- Po dostosowaniu pH wyrównaj objętość w każdej probówce za pomocą 140 mM NaCl, 5 mM roztworu KCl (pH 6,7), mierząc masę probówki z wartością docelową 15 g.
UWAGA: W przypadku niektórych produktów spożywczych może być konieczne zwiększenie całkowitej objętości do 16 g lub 17 g, w zależności od pojemności buforowej żywności.
- Przenieść 1,5 ml każdego trawienia jelitowego do górnej komory (tj. zawierającej pierścień wprowadzający z membraną dializacyjną) odpowiedniego dołka 6-dołkowej płytki hodowlanej zawierającej komórki Caco-2 (ryc. 1B).
- Założyć pokrywę płytki i inkubować w temperaturze 37 °C (5% CO2 atmosfery powietrza) na wytrząsarce kołyszącej się z prędkością 6 oscylacji/min przez 2 godziny.
- Zdejmij pierścień wkładający z trawieniem i dodaj dodatkowy 1 ml MEM (pH 7) do każdej studzienki.
- Umieścić płytkę z kulturą komórkową z powrotem w inkubatorze (37 °C; 5% atmosfery powietrza CO2 ) na dodatkowe 22 godziny.
- Po 22 godzinach usunąć pożywkę do hodowli komórkowych i dodać 2,0 ml wody o mocy 18 MΩ do monowarstwy komórek.
UWAGA: Woda będzie osmotycznie lizować komórki.
- Zbierz cały lizat komórkowy do standardowych probówek do mikrowirówek polipropylenowych lub podobnych w celu przeprowadzenia kolejnych analiz białek komórkowych i ferrytyny komórkowej.
