$$\rightleftharpoonup{xx}$$
$$\longleftharp{xx}$$,
$$\longrightharp{xx}$$,
UWAGA: Wszystkie procedury muszą być wykonywane w komorze bezpieczeństwa biologicznego klasy II, przy włączonej dmuchawie i zgaszonym świetle.
1. Przygotowanie materiałów
UWAGA: Wszystkie materiały są wymienione w Tabeli Materiałów.
- Przygotować pożywkę 1, pożywkę wirującą 2 oraz roztwory do przechowywania i robocze fluorescencyjnego 2-deoksy-2-[(7-nitro-2,1,3-benzoksadiazol-4-ylo)amino]-D-glukozy (2-NBDG lub FD-glukozy) zgodnie z tabelą 1 w komorze bezpieczeństwa biologicznego klasy II. Chroń FD-glucose przed światłem przez cały czas trwania eksperymentu, wyłączając wszystkie światła pod maską.
- Używaj gotowych do użycia odczynników do hodowli komórkowych: Trypsyna-EDTA, sól fizjologiczna buforowana fosforanami (PBS) oraz bezglukozowa i pozbawiona czerwieni fenolowej pożywka Dulbecco's Modified Eagle Medium (zwana dalej DMEM bez glukozy).
- Użyj 20 ml buforu do lizy testu radioimmunoprecypitacji (RIPA).
UWAGA: W poniższych sekcjach porównano zewnątrzkomórkowe wyczerpanie i wewnątrzkomórkowy wychwyt różnych dawek FD-glukozy w fibroblastach 3T3-L1 ze stymulacją insuliną i bez niej (ryc. 1).
2. Hodowla i utrzymanie komórek 3T3-L1
- Hodowla mysich fibroblastów 3T3-L1 przez posiew 1 x 106 komórek rozcieńczonych w 20 ml pożywki 1 na dwóch 96-dołkowych płytkach. Na dołek należy podać 100 μl zawiesiny komórek, zapewniając utrzymanie jednorodności tej zawiesiny przez mieszanie. Hoduj komórki przez 48 godzin w inkubatorze o temperaturze 37 °C (5%CO2 i 95% wilgotności) bez zmiany pożywki do około 70%-80% zgryzu.
- Utrzymuj komórki zlewające się i na czczo, hodując je w tym samym podłożu przez 48 godzin. Zmieniaj czas inkubacji od 24 do 72 godzin w zależności od pożądanego stanu katabolicznego na czczo.
3. Głód komórek 3T3-L1
- Dekantacja pożywki z komórek w płytkach 96-dołkowych. Wchłonąć pozostały płyn za pomocą sterylnych ręczników papierowych.
- Opłucz 96-dołkową płytkę 100 μl PBS na studzienkę i wchłonij pozostały płyn sterylnymi ręcznikami papierowymi.
- Dodać 100 μl bezglukozowego DMEM do dołka i inkubować przez 40 minut. Dostosuj czas inkubacji w zależności od typu komórki, bodźców i pożądanego poziomu postu.
UWAGA: Czas inkubacji może wymagać optymalizacji w zależności od pory roku.
4. Przygotowanie roztworów FD-glucose o różnych stężeniach
UWAGA: Eksperyment na rysunku 1 bada media zewnątrzkomórkowe i międzykomórkowe ze stymulacją insuliną i bez niej.
- Użyć ośmiu powtórzeń (jeden rząd na płytce 96-dołkowej) dla każdego warunku stymulacji. W związku z tym należy przygotować 1 ml dla każdego warunku stymulacji (określonego w Tabeli 2 i poniżej).
- Użyj ośmiu warunków stymulacji bez insuliny: FD-glukoza 2,5 μg/ml, 1 μg/ml, 0,5 μg/ml, 0,2 μg/ml, 0,1 μg/mL, 0,05 μg/ml i 0 μg/ml (kontrola bez FD-glukozy) na jednej 96-dołkowej płytce.
- Użyj ośmiu warunków stymulacji insuliną (10 μg/ml, stężenie końcowe): FD-glukoza 2,5 μg/mL, 1 μg/mL, 0,5 μg/mL, 0,2 μg/mL, 0,1 μg/mL, 0,05 μg/ml i 0 μg/ml (kontrola bez FD-glukozy) na innej 96-dołkowej płytce.
- Aby przygotować warunki stymulacji, rozcieńczyć 1 μl roztworu roboczego FD-glukozy o stężeniu 5 mg/ml (Tabela 1) w 999 μl DMEM bez glukozy, aby otrzymać 1 ml roboczego roztworu podstawowego (rozcieńczenie 1:1000 lub 5 μg/ml).
- Korzystając z tego roboczego roztworu podstawowego, przygotuj 1:2000, 1:5000, 1:10 000, 1:25 000, 1:50 000 i 1:100 000 rozcieńczenia FD-glukozy w celu uzyskania 2,5 μg / ml, 1 μg / ml, 0,5 μg / ml, 0,2 μg / mL, 0,1 μg / ml i 0,05 μg / ml (Tabela 2) w probówkach o pojemności 2 ml bezpośrednio przed eksperymentami w komorze bezpieczeństwa biologicznego bez świateł.
- Powtórzyć krok 4.4 i dodać 1 μl insuliny (10 mg/ml, stężenie końcowe) do każdego z warunków określonych powyżej.
UWAGA: Końcowe stężenie insuliny w tych próbkach wynosi 10 μg/ml = 1,7 nmol/mL. Aby uzyskać homogenizację, dodaj insulinę do probówek przed dodaniem innych roztworów.
5. Leczenie wygłodzonych komórek 3T3-L1
- Po 40 minutach inkubacji zdekantować wolny od glukozy DMEM z każdej studzienki na 96-dołkowe płytki i wchłonąć pozostały płyn sterylnymi ręcznikami papierowymi.
- Dodać po 100 μl (na studzienkę) z różnych warunków uzdatniania opisanych powyżej do studzienek wzdłuż jednej kolumny i 100 μl (na studzienkę) z tego samego stanu uzdatniania do studzienek wzdłuż rzędu (osiem powtórzeń) w obu płytkach 96-dołkowych. Oznacz płytki, na których wykorzystano warunki, z insuliną i bez insuliny. Dodać sam DMEM bez glukozy do studzienek kontrolnych (n = 8).
- Inkubować płytkę przez 40 minut w inkubatorze do hodowli komórkowych (37 °C, 5% CO2 i 95% wilgotności) w ciemności.
6. Pomiary zewnątrzkomórkowe i międzykomórkowe dla stymulowanych komórek 3T3-L1
- Po stymulacji komórek przez 40 minut, przenieś pożywkę stymulacyjną z obu płytek na nowe 96-dołkowe płytki, zachowując ten sam układ eksperymentalny.
- Zdekantować pozostały roztwór z oryginalnie stymulowanych 96-dołkowych płytek z komórkami na sterylnych ręcznikach papierowych.
- Opcjonalnie umyj komórki PBS. Usuń PBS i zdekantuj pozostały roztwór na sterylnych ręcznikach papierowych.
- Dodać 100 μl buforu do lizy RIPA do każdej studzienki. Opcjonalnie dodaj inhibitor proteazy do buforu RIPA w celu ochrony białek. Umieść płytki zawierające RIPA w shakerze na 30 minut.
- Za pomocą czytnika mikropłytek (tabela materiałów) zmierz fluorescencję przy długościach fal wzbudzenia (Ex) i emisji (Em) odpowiednio 485 i 535 nm, najpierw w pożywce zawierającej zewnątrzkomórkową FD-glukozę, a następnie na płytce z komórkami zmielonymi lizą RIPA pod koniec 30-minutowej inkubacji (patrz krok 6.4).
Tabela 1: Przygotowanie pożywek hodowlanych i roztworów FD-glukozy.
| Roztwór/Pożywka | Składniki |
| Etanol:DMSO (1:1/v/v) | Etanol (200 μl) i DMSO (200 μl) w probówce o pojemności 1-1,5 ml; użyj etanolu do hodowli komórkowych i DMSO |
| Średni 1 | DMEM (89 ml), penicylina/streptomycyna (1%) (1 ml) i surowica cielęca (10%) (10 ml) w sterylnej probówce o pojemności 50 ml |
| Pożywka wirowa 2 | DMEM (89 ml), penicylina/streptomycyna (1%) (1 ml) i surowica bydlęca (10%) (10 ml) w sterylnej probówce o pojemności 50 ml |
| Przechowywanie FD-roztwór glukozy 5 mg/ml (14,5 mM) | FD glukozy (1 mg) i etanolu: DMSO (1:1/v/v) (200 μl) w probówce 0,5 ml; przechowywać w temperaturze -80 °C, najlepiej w atmosferze argonu lub azotu |
| Roboczy roztwór glukozy FD 5 μg/ml (14,5 mM) | Przechowywanie roztworu glukozy FD 5 mg/ml (1 μL), DMEM bez glukozy (999 μL); przygotować bezpośrednio przed eksperymentem. |
Tabela 2: Przygotowanie roztworów FD-glukozy o różnych stężeniach do eksperymentów pokazanych na rysunku 1.
pkt.
szt.
szt.
szt.
szt.
szt.
szt.
szt.
szt.
szt.
szt.
| Rozcieńczeniu | kontrola | 1:2x103 | 1:5x103 | 1:1x104 | 1:2.5x104 | 1:5x104 | 1:1x105 |
| Stężenie (μg/ml) | 0 | Rozdział 2.5 | 1 | 0,5 | 0,2 | 0,1 | 0,05 |
| DMEM bez glukozy (μL) | 1000 | 500 | 800 | 900 | 960 | Okręg wyborczy 980 | 990 |
| FD Glukoza 5 μg/ml (μL) | 0 | 500 | 200 | 100 | Rozdział 40 | 20 | 10 |
