Pomiar zubożenia analogu glukozy we fluorescencji zewnątrzkomórkowej: zastępcza technika pomiarowa do oceny wychwytu glukozy w narządach myszy ex vivo

W tym artykule

Streszczenie

Źródło: Kumar, S. B. et al., Zewnątrzkomórkowe wyczerpanie glukozy jako pośrednia miara wychwytu glukozy w komórkach i tkankach ex vivo.J. Vis. Exp.(2022)

W tym filmie demonstrujemy technikę ex vivo do pomiaru wyczerpania zewnątrzkomórkowego analogu glukozy w pobranych narządach myszy. Polega na inkubacji tkanki myszy w roztworze zawierającym znakowaną fluorescencyjnie deoksyglukozę, która jest pobierana przez komórki. Wychwyt analogu glukozy można pośrednio określić, mierząc fluorescencję inkubowanej pożywki.

Protokół

Wszystkie procedury dotyczące modeli zwierzęcych zostały sprawdzone przez lokalny instytucjonalny komitet opieki nad zwierzętami oraz weterynaryjną komisję rewizyjną JoVE.

UWAGA: Wszystkie procedury muszą być wykonywane w komorze bezpieczeństwa biologicznego klasy II, przy włączonej dmuchawie i zgaszonym świetle.

1. Przygotowanie materiałów

UWAGA: Wszystkie materiały są wymienione w Tabeli Materiałów.

Przygotować pożywkę 1, pożywkę wirującą 2 oraz roztwory do przechowywania i robocze fluorescencyjnego 2-deoksy-2-[(7-nitro-2,1,3-benzoksadiazol-4-ylo)amino]-D-glukozy (2-NBDG lub FD-glukozy) zgodnie z tabelą 1 w komorze bezpieczeństwa biologicznego klasy II. Chroń FD-glucose przed światłem przez cały czas trwania eksperymentu, wyłączając wszystkie światła pod maską.
Używaj gotowych do użycia odczynników do hodowli komórkowych: Trypsyna-EDTA, sól fizjologiczna buforowana fosforanami (PBS) oraz bezglukozowa i pozbawiona czerwieni fenolowej pożywka Dulbecco's Modified Eagle Medium (zwana dalej DMEM bez glukozy).

2. Pomiar ex vivo zewnątrzkomórkowego wyczerpania FD-glukozy w narządach

Wstępnie potraktuj myszy związkami stymulującymi metabolizm glukozy przed rozwarstwieniem narządu, w następujący sposób.
Użyj dziewięciotygodniowych samców myszy Lep^ob (n = 11). Przed eksperymentem nakarm wszystkie myszy regularną dietą żywieniową.
Losowo przypisz myszy do trzech grup do wstrzyknięć dootrzewnowych (i.p.).
1. Myszy z grupy kontrolnej Lep^ob należy wstrzyknąć 0,1 ml sterylnego PBS (n = 4).
2. Myszom z grupy insuliny Lep^ob wstrzyknąć 0,1 ml sterylnego PBS, zawierającego 12 j.m. insuliny ludzkiej na gram masy ciała (BW) (n = 3).
3. Wstrzyknąć myszom z grupy AAC2 Lep^ob 0,1 ml sterylnego PBS, zawierającego 0,1 nmol AAC2 na gram masy ciała (BW) (n = 4).
Po 15 minutach poddaj myszy inhalacji 5% izofluranu i krwi wykrwawiającej się przez nakłucie serca od znieczulonych zwierząt.
Wypreparuj trzewną, nabłonkową białą tkankę tłuszczową (200 mg), wątrobę (200 mg) i cały mózg każdego zwierzęcia. Do obchodzenia się z tkankami należy używać kaptura bezpieczeństwa biologicznego klasy II.
Przygotować roztwór roboczy FD-glucose (0,29 mM) w bezglukozowym DMEM w komorze bezpieczeństwa biologicznego klasy II bez światła.
Zmierzyć fluorescencję roztworu roboczego FD-glukozy (0,29 mM) przy długościach fal wzbudzenia i emisji odpowiednio 485 i 535 nm za pomocą czytnika mikropłytek.
Inkubować pobrane tkanki/narządy na 6-dołkowej płytce zawierającej PBS przez 1 minutę. Każdą tkankę lub narząd należy umieścić w oddzielnym dołku.
Po 1 minucie umieść każdą chusteczkę na sterylnym ręczniku papierowym, aby wchłonął PBS. Przenieś tkanki/narządy na oddzielną 6-dołkową płytkę zawierającą 4 000 μl bezglukozowego DMEM i inkubuj przez 2 minuty.
Po 2 minutach wyjąć i przenieść tkanki do studzienek 6-dołkowej płytki zawierającej 0,29 mM roztworu roboczego FD-glukozy (1 ml / dołek). Inkubować 6-dołkowe płytki zawierające tkanki w roztworze roboczym FD-glukozy w temperaturze 37 °C (5% CO₂ i 95% wilgotności).
Zebrać 100 μl roztworu roboczego FD-glukozy z każdego dołka po 0, 10, 20, 30, 40, 60, 90 i 120 minutach inkubacji, aby przeanalizować kinetykę zewnątrzkomórkowego wyczerpania glukozy FD. Wstrząsnąć przed i po pobraniu.
Przenieść 100 μl roztworu roboczego FD-glukozy do 96-dołkowych płytek w celu zmierzenia fluorescencji przy długościach fal wzbudzenia i emisji odpowiednio 485 i 535 nm, za pomocą czytnika mikropłytek.
Znormalizuj fluorescencję do wartości 0 min (100%) dla każdego narządu u każdego zwierzęcia (ryc. 1).

Tabela 1: Przygotowanie pożywek hodowlanych i roztworów FD-glukozy.

Roztwór/Pożywka	Składniki
Etanol:DMSO (1:1/v/v)	Etanol (200 μl) i DMSO (200 μl) w probówce o pojemności 1-1,5 ml; użyj etanolu do hodowli komórkowych i DMSO
Średni 1	DMEM (89 ml), penicylina/streptomycyna (1%) (1 ml) i surowica cielęca (10%) (10 ml) w sterylnej probówce o pojemności 50 ml
Pożywka wirowa 2	DMEM (89 ml), penicylina/streptomycyna (1%) (1 ml) i surowica bydlęca (10%) (10 ml) w sterylnej probówce o pojemności 50 ml
Przechowywanie FD-roztwór glukozy 5 mg/ml (14,5 mM)	FD glukozy (1 mg) i etanolu: DMSO (1:1/v/v) (200 μl) w probówce 0,5 ml; przechowywać w temperaturze -80 °C, najlepiej w atmosferze argonu lub azotu
Roboczy roztwór glukozy FD 5 μg/ml (14,5 mM)	Przechowywanie roztworu glukozy FD 5 mg/ml (1 μL), DMEM bez glukozy (999 μL); przygotować bezpośrednio przed eksperymentem.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

figure-results-1
Rycina 1: Kinetyka zewnątrzkomórkowego wyczerpania FD-glukozy w różnych narządach ex vivo. (AC) Myszom Lep^ob wstrzyknięto nośnik (PBS, n = 4), insulinę (12 IU / kg BW, n = 3) i AAC2 (1 nmol / g BW, n = 3). Po 15 minutach tkanki zostały wypreparowane i wyizolowane. Eksplantaty (A) tłuszczu trzewnego, (B) wątroby i (