$$\rightleftharpoonup{xx}$$
$$\longleftharp{xx}$$,
$$\longrightharp{xx}$$,
Wszystkie procedury z udziałem ludzi zostały przeprowadzone zgodnie z instytucjonalnymi, krajowymi i międzynarodowymi wytycznymi dotyczącymi dobrostanu ludzi i zostały zweryfikowane przez lokalną instytucjonalną komisję rewizyjną
1. Pomiar skurczu (przykładowe SMC)
- Przygotuj matrycę ECIS 96w10e (patrz rysunek 1A dla reprezentatywnego obrazu matrycy z powiększonymi elektrodami i komórkami umieszczonymi na elektrodach).
UWAGA: Wykonaj następujące czynności pod sterylnym kapturem z przepływem laminarnym do hodowli tkankowych.
- Pokryj sterylną tablicę 96w10e 200 μl 10 mM L-cysteiny na studzienkę przez 30 minut w temperaturze pokojowej.
- Umyj płytkę dwukrotnie sterylną wodą. Pozostaw płytkę do wyschnięcia na noc w kapturze do hodowli tkankowych z lekko uchyloną pokrywką.
UWAGA: Pokrycie płytki L-cysteiną jest konieczne tylko przy pierwszym użyciu płytki.
- Następnego dnia wysterylizuj płytkę i pokrywkę promieniami UV przez 30 minut. Obróć pokrywkę do góry, aby wnętrze było wysterylizowane. Po wysterylizowaniu płytki nie należy otwierać płytki na zewnątrz okapu przepływowego.
- Inicjowanie komórek w tablicy ECIS
- Podgrzej 1% sterylny roztwór żelatyny w łaźni wodnej przez 30 min.
UWAGA: Roztwór jest przechowywany w lodówce i może zastygnąć, co utrudnia pipetowanie.
- Następnie pokryć studzienki 100 μl 1 % roztworu żelatyny na studzienkę i inkubować płytkę w temperaturze 37 °C przez co najmniej 1 godzinę.
- Odessać żelatynę ze studzienek.
- Policz komórki za pomocą automatycznego licznika komórek i zasiej SMC w trzech egzemplarzach przy gęstości wysiewu 30 000 komórek/dołek w 200 μl pożywki SMC.
- Umieścić płytkę z SMC w uchwycie ECIS 96-dołkowym w inkubatorze do hodowli komórkowych. Kliknij dwukrotnie oprogramowanie ECIS Applied Biophysics, aby otworzyć program i naciśnij przycisk Setup.
- Sprawdź, czy wszystkie elektrody stykają się z uchwytem (zielony; czerwony w przypadku braku połączenia) w lewym dolnym panelu oznaczonym Konfiguracja studni. Jeśli elektrody nie są prawidłowo podłączone, wyreguluj płytkę w uchwycie przed rozpoczęciem pomiaru.
- Wybierz typ płyty (tablica 96-dołkowa) w tym samym panelu, klikając opcję Typ tablicy.
- W prawym górnym panelu Ustawienia zbierania danych kliknij pojedynczą częstotliwość i zmień wartość impedancji na 4000 Hz, a interwał na 8 s.
- Kliknij przycisk Start, aby rozpocząć pomiary. Poczekaj, aż otworzy się nowy panel, w którym można zapisać plik ECIS.
- Pozwól komórkom się przyłączyć i utwórz monowarstwę przez 48 godzin
UWAGA: Przyczepienie i rozłożenie ogniw na elektrodach generuje podstawową wartość rezystancji (rysunek 1B).
- Stymulacja komórek w celu wywołania skurczu
- Indukuj skurcz SMC poprzez stymulację komórek 10 μg/ml jonoforu wapnia, jonomycyny.
UWAGA: Jonomycyna indukuje napływ zewnątrzkomórkowego Ca2+, aktywując kaskadę skurczową; patrz rysunek 2A dla reprezentatywnych obrazów niestymulowanych i stymulowanych skurczonych komórek.
- Rozcieńczyć 1 mg proszku jonomycyny w 100 μl dimetylosulfotlenku do uzyskania roztworu podstawowego 10 mg/ml i przechowywać 10 μl podwielokrotności w temperaturze -20 °C. Przed użyciem rozcieńczyć roztwór jonomycyny w stosunku 1:10 w pożywce SMC, aby przygotować roztwór roboczy, który zostanie dodany do komórek.
- Stymulację komórek należy przeprowadzić, gdy matryca nadal znajduje się w uchwycie macierzy wewnątrz inkubatora do hodowli komórkowych, a elektrody są przymocowane do systemu.
- Aby pobudzić komórki, zdejmij pokrywę i umieść ją na sterylnej powierzchni wewnątrz inkubatora. Przygotować dwie pipety, ustawione na 2 μl i 150 μl.
- Przed rozpoczęciem stymulacji naciśnij Zaznacz w oprogramowaniu i umieść komentarz.
UWAGA: Ułatwi to znalezienie dokładnego czasu stymulacji podczas analizy danych.
- Odpipetować 2 μl roztworu roboczego jonomycyny do każdego dołka tak szybko, jak to możliwe. Po stymulacji wszystkich komórek wymieszać pożywkę w studzienkach za pomocą drugiej pipety.
UWAGA: Ze względu na szybkie efekty nie jest konieczna zmiana końcówek między różnymi liniami komórkowymi i warunkami. Działaj szybko, stymulując i mieszając, ponieważ jonomycyna ma ostre działanie. Podczas stymulacji pełnego talerza stymuluj maksymalnie 3 kolumny jednocześnie. Po każdej stymulacji należy odczekać co najmniej 30 minut do następnej stymulacji, aby komórki mogły dojść do siebie po zmianie temperatury i CO2 spowodowanej otwarciem drzwi inkubatora.
- Bezpośrednio po zakończeniu stymulacji ponownie naciśnij przycisk Mark, aby dodać komentarz, że stymulacja została zakończona.
- Zakończenie eksperymentu ze stymulacją
- Zapisuj wartości impedancji przez około 5 minut po stymulacji jonomycyną. Zakończ nagrywanie, naciskając przycisk Zakończ.
