Test odwróconej ruchliwości: technika in vitro do wizualizacji ruchu miozyny na unieruchomionych włóknach aktyny

Streszczenie

Źródło: Tripathi, A., et al. Specyficzne dla miozyny adaptacje testów ruchliwości opartych na mikroskopii fluorescencyjnej in vitro. J. Vis. Exp. (2021).

W tym filmie przeprowadzamy test ruchliwości in vitro, aby przeanalizować interakcje aktyna-miozyna. Ślizgający się ruch włókien aktynowych na unieruchomionych cząsteczkach miozyny jest wizualizowany za pomocą mikroskopii fluorescencyjnej.

Protokół

1. Oczyszczanie białka

1. Liza komórek i ekstrakcja białek
   1. Przygotuj 1,5x bufor ekstrakcyjny w oparciu o Tabelę 1. Przefiltrować i przechowywać w temperaturze 4 °C.
   2. Rozpocznij rozmrażanie granulek komórkowych na lodzie. Podczas rozmrażania granulek uzupełnij 100 ml buforu ekstrakcyjnego 1,2 mM ditiotreitolem (DTT), 5 μg/ml leupeptyny, 0,5 μM fluorku fenylometylosulfonylu (PMSF) i dwiema tabletkami inhibitora proteazy. Trzymaj na lodzie.
   3. Po rozmrożeniu osadu dodać 1 ml uzupełnionego buforu ekstrakcyjnego na 10 ml hodowli komórkowej. Na przykład, jeśli osadki komórkowe zostały utworzone z 500 m....

Wyniki

Rysunek 1: Przygotowanie funkcjonalizowanych komór przepływowych.(A) Zacznij od oczyszczonego szkiełka mikroskopowego, dwóch kawałków taśmy dwustronnej przyciętych na około 2 cm i funkcjonalnego szkiełka nakrywkowego. (B) Dodaj taśmę do środka szkiełka mikroskopowego. (C) Przymocuj szkiełko nakrywkowe do taśmy powłoką skierowaną w dół i delikatnie d.......

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
2 M roztwór MgCl2	Firma VWR	Numer katalogowy: 10128-298
5 M roztwór NaCl	Firma KD Medical	RGE-3270
kwas octowy	ThermoFisher Naukowy	984303
Żel powinowactwa Anti-FLAG M2	Millipore Sigma	A2220	https://www.sigmaaldrich.com/content/dam/sigma-aldrich/docs/Sigma/Bulletin/a2220bul.pdf
Atp	Millipore Sigma	A7699
Biotynylowana G-aktyna	Cytoszkielet, Inc.	Zobacz materiał AB07
Albumina surowicy bydlęcej	Millipore Sigma	Numer katalogowy: 5470
bPEG-silan	Laysan Bio, Inc	Biotyna-PEG-SIL-3400-1g
Koncentrat odczynnika Bradford	Bio-Rad	5000006
Kalmodulina		PMID: 2985564
Katalazy	Millipore Sigma	Zobacz materiał C40
Linia komórkowa (Sf9) w SF-900 II SFM	ThermoFisher Naukowy	11496015	http://tools.thermofisher.com/content/sfs/manuals/bevtest.pdf https://tools.thermofisher.com/content/sfs/manuals/bactobac_man.pdf
Okrągła bibuła filtracyjna - test odwrócony	Millipore Sigma	WHA1001090
Kompletne, wolne od EDTA tabletki z inhibitorem proteazy	Millipore Sigma	5056489001	Powinien on być przechowywany w temperaturze 4 °C. Tabletki mogą być używane bezpośrednio lub mogą być rozpuszczone w postaci 25-krotnego roztworu podstawowego, rozpuszczając 1 tabletkę w 2 ml wody destylowanej. Otrzymany roztwór można przechowywać w temperaturze 4 °C przez 1-2 tygodnie lub co najmniej 12 tygodni w temperaturze -20 °C.
Rury koncentracyjne (100 000 MWCO)	Korporacja EMD Millipore	UFC910024	MWCO probówki niekoniecznie jest "uniwersalny", o ile MWCO jest mniejsze niż całkowita masa cząsteczkowa oczyszczanego białka. M5a został skoncentrowany za pomocą lampy o mocy 30 000 MWCO.
Barwnik Coomassie Brilliant Blue R-250	ThermoFisher Naukowy	Numer katalogowy: 20278
Stojak na szkiełka nakrywkowe	Millipore Sigma	Z688568-1EA
Szkiełka nakrywkowe: test odwróconej ruchliwości	Azer Naukowy	ES0107052
Rurki do dializy (3500 daltonów MCWO)	Fischer Naukowy	08-670-5A	Średnica rurki dializacyjnej może się różnić, ale MWCO powinno być takie samo. Probówki można przechowywać w 20% roztworze alkoholu w temperaturze 4 °C.
DL-ditiotreitol	Millipore Sigma	D0632
Taśma dwustronna	Magazyn biurowy	909955
Peptyd DYKDDDDK	Język GenScript	RP10586	Można go rozpuścić w buforze zawierającym 0,1 M NaCl, 0,1 mM EGTA, 3 mM NaN3 i 10 mM MOPS (pH 7,2) do końcowego stężenia 50 mg/ml. Można go przechowywać w temperaturze -20 °C jako podwielokrotności 300 μl.
EGTA (EGTA)	Millipore Sigma	E4378
Kolumna elucyjna	Bio-Rad	Nr kat. 761-1550	Można je ponownie wykorzystać. Aby wyczyścić, przepłucz kolumnę 2-3 objętościami PBS i wodą destylowaną. Przed użyciem schłodzić kolumnę w temperaturze 4°C.
etanol	Fischer Naukowy	Certyfikat A4094
glukoza	Millipore Sigma	Kontroler G8270
Oksydaza glukozowa	Millipore Sigma	Zobacz materiał G2133
Roztwór buforowy glicyny, 100 mM, pH 2-2,5, 1 l	Biotechnologia Santa Cruz	SC-295018
Hcl	Millipore Sigma	320331
Kcl	Fischer Naukowy	Zobacz materiał P217-500
Końcówki do pipet z dużym otworem	Fischer Naukowy	Numer katalogowy: 02-707-134
Inhibitor proteazy leupeptyny	ThermoFisher Naukowy	Numer telefonu 78435
Mark12 Nieplamiona drabina standardowa	ThermoFisher Naukowy	LC5677
metanol	Millipore Sigma	MX0482
Szkiełka mikroskopowe	Fischer Naukowy	Numer katalogowy: 12-553-10
Mopy	Fischer Naukowy	Zobacz materiał BP308-100
mPEG-silan	Laysan Bio, Inc	MPEG-SIL-2000-1g
NaN3	Millipore Sigma	Zobacz materiał S8032
NeutrAwidyna	ThermoFisher Naukowy	Numer katalogowy: 31050
NuPAGE 4 do 12% Bis-Tris Mini żel białkowy, 15-dołkowy	ThermoFisher Naukowy	NP0323PK2
Bufor próbki NuPAGE LDS (4X)	ThermoFisher Naukowy	NP0007
sól fizjologiczna buforowana fosforanami, pH 7,4	ThermoFisher Naukowy	10010023
PMSF (Kanał PMSF)	Millipore Sigma	Numer telefonu 78830	PMSF może być wytwarzany w postaci 0,1 M roztworu podstawowego w izopropanolu i przechowywany w temperaturze 4 °C. Dodanie izopropanolu powoduje wytrącanie się kryształów, które można rozpuścić przez mieszanie w temperaturze pokojowej. Bezpośrednio przed użyciem PMSF można dodawać kroplami do szybko mieszającego roztworu do końcowego stężenia 0,1 mM.
Żyletki	Magazyn biurowy	397492
Rodamina-falloidyna	ThermoFisher Naukowy	Czynnik chłodniczy R415	Bulion można rozcieńczyć w 100% metanolu do końcowego stężenia 200 μM.
Nośniki SF9	ThermoFisher Naukowy	Numer katalogowy: 12658-027	Powinien być przechowywany w temperaturze 4°C. Jego okres trwałości wynosi 18 miesięcy od daty produkcji.
Naczynie do hodowli tkankowych - test odwrócony	Corning	353003	Każde naczynie do hodowli tkankowej może pomieścić około czterech szkiełek nakrywkowych.
Końcówki do pipet o gładkich ściankach 200 μl	Thomas Naukowy	Numer katalogowy: 1158U38
sprzęt
wirówka	ThermoFisher Naukowy	75006590
mikroskop	Nikon	Model: Eclipse Ti z systemem H-TIRF z obiektywem 100x TIRF (brak 1,49)
Kamera mikroskopowa	Andor	Model: Kamera iXon DU888 EMCCD (format czujnika 1024 x 1024)
Mikroskopowa skrzynka kontrolna	HIT Tokai	Niestandardowy Thermobox
Jednostka laserowa mikroskopu	Nikon	Czteroczęściowy zespół laserowy LU-n4 z laserami półprzewodnikowymi dla 405 nm, 488 nm, 561 nm i 640 nm
Wirówka środkowa	ThermoFisher Naukowy	Modelu: CR3i
Dźwiękowiec Misonix	Misonix (Język misonix	XL2020
Ultrawirówka stołowa Optima Max-XP	Beckman Coulter	393315
Czyściciel plazmowy	Diener electronic GmbH + Co. KG	Typ systemu: Zepto
Sonda sonicyjna (3,2 mm)	Qsonica powiedział:	Numer katalogowy: 4418
Standardowy inkubator	spoiwo	Modelka: 56
Mikser rurowy Waverly	Waverly	TR6E

powiedział: (wersja angielska) powiedział: powiedział: powiedział: TGL powiedział: powiedział: powiedział: powiedział: środowiska ) powiedział: