Test odwróconej ruchliwości: technika in vitro do wizualizacji ruchu miozyny na unieruchomionych włóknach aktyny

Streszczenie

Źródło: Tripathi, A., et al. Specyficzne dla miozyny adaptacje testów ruchliwości opartych na mikroskopii fluorescencyjnej in vitro. J. Vis. Exp. (2021).

W tym filmie przeprowadzamy test ruchliwości in vitro, aby przeanalizować interakcje aktyna-miozyna. Ślizgający się ruch włókien aktynowych na unieruchomionych cząsteczkach miozyny jest wizualizowany za pomocą mikroskopii fluorescencyjnej.

Protokół

1. Oczyszczanie białka

1. Liza komórek i ekstrakcja białek
   1. Przygotuj 1,5x bufor ekstrakcyjny w oparciu o Tabelę 1. Przefiltrować i przechowywać w temperaturze 4 °C.
   2. Rozpocznij rozmrażanie granulek komórkowych na lodzie. Podczas rozmrażania granulek uzupełnij 100 ml buforu ekstrakcyjnego 1,2 mM ditiotreitolem (DTT), 5 μg/ml leupeptyny, 0,5 μM fluorku fenylometylosulfonylu (PMSF) i dwiema tabletkami inhibitora proteazy. Trzymaj na lodzie.
   3. Po rozmrożeniu osadu dodać 1 ml uzupełnionego buforu ekstrakcyjnego na 10 ml hodowli komórkowej. Na przykład, jeśli osadki komórkowe zostały utworzone z 500 ml hodowli komórkowej, dodaj 50 ml uzupełnionego buforu ekstrakcyjnego do osadu.
   4. Poddaj sonikacji granulki komórek, utrzymując je na lodzie. Dla każdej pastylki należy zastosować następujące warunki: 5 s WŁ., 5 s WYŁ., czas trwania 5 min, moc 4-5.
   5. Zebrać cały homogenizowany lizat do zlewki i dodać ATP (0,1 M roztwór podstawowy; pH 7,0) tak, aby końcowe stężenie ATP wynosiło 1 mM. Mieszaj przez 15 minut w chłodnym pomieszczeniu. ATP dysocjuje aktywną miozynę od aktyny, umożliwiając jej oddzielenie w następnym etapie wirowania. Dlatego ważne jest, aby natychmiast przejść do następnego kroku, aby zminimalizować możliwość wyczerpania ATP i ponownego wiązania się z aktyną.
   6. Odwirować lizaty w temperaturze 48 000 x g przez 1 godzinę w temperaturze 4 °C. W tym czasie należy rozpocząć płukanie 1-5 ml 50% zawiesiny żywicy o powinowactwie Anti-FLAG (dla osadu utworzonego z 1 litra komórek) 100 ml soli fizjologicznej buforowanej fosforanami (PBS), zgodnie z instrukcjami producenta. Na przykład na 5 ml żywicy umyj 10 ml 50% zawiesiny. Na ostatnim etapie mycia ponownie zawiesić żywicę z 1-5 ml PBS o objętości wystarczającej do wytworzenia 50% zawiesiny.
   7. Po odwirowaniu lizatu połączyć supernatant z przemytą zawiesiną żywicy i delikatnie rozdrabniać w chłodni przez 1-4 godziny. W czasie oczekiwania należy sporządzić opisane w tabeli 1 i przechowywać je na lodzie.
2. Preparat oczyszczający powinowactwo FLAG
   1. Odwirować roztwór opisany w kroku 1.7 przy 500 x g przez 5 minut w temperaturze 4 °C. Żywica zostanie zapakowana na dnie tuby. Nie naruszając żywicy, usuń supernatant.
   2. Zawiesić żywicę w 50 ml buforu A, jak opisano w tabeli 1 i odwirować przy 500 x g przez 5 minut w temperaturze 4 °C. Nie naruszając żywicy, usuń supernatant.
   3. Zawiesić żywicę w 50 ml buforu B, jak opisano w tabeli 1 i odwirować przy 500 x g przez 5 minut w temperaturze 4 °C. Powtórzyć ten krok jeszcze raz i ponownie zawiesić żywicę w 20 ml buforu B. Następnie dokładnie wymieszaj żywicę i bufor, delikatnie odwracając ręcznie probówkę około 10 razy.
3. Elucja i koncentracja białek
   1. Przygotować 30 ml buforu elucyjnego zgodnie z opisem w Tabeli 1 i pozostawić do ochłodzenia na lodzie.
   2. Ustaw kolumnę elucyjną w chłodni. Delikatnie wlej zawiesinę żywicy do kolumny. Umyj kolumnę 1-2 objętościami buforu B, gdy żywica pakuje się na dnie, upewniając się, że żywica nie wysycha.
   3. Przepuść 1 ml buforu elucyjnego przez żywicę i zbierz przepływ do probówki o pojemności 1,5 ml. Powtórz tak, aby zebrać 12, 1 ml frakcji.
   4. W tym momencie wykonaj surowy test Bradforda na frakcjach, aby jakościowo określić, które frakcje są najbardziej skoncentrowane. Na jednym rzędzie płytki 96-dołkowej odpipetować 60 μl 1x odczynnik Bradford. Po zebraniu frakcji wymieszaj 20 μl każdej frakcji na studzienkę. Ciemniejsze niebieskie zabarwienie wskazuje na bardziej skoncentrowane frakcje.
   5. W probówce o pojemności 50 ml zebrać pozostałe białko, delikatnie pipetując pozostały bufor elucyjny przez kolumnę, aby uwolnić pozostałą miozynę związaną z żywicą w przepływie przez kolumnę. Ten przepływ zostanie skoncentrowany w następnym kroku. Upewnij się, że żywica jest następnie regenerowana do ponownego użycia i przechowywana zgodnie z instrukcjami producenta.
   6. Zebrać trzy najbardziej skoncentrowane frakcje i dalej zagęścić przepływ w probówce o pojemności 50 ml, a także pozostałe frakcje o pojemności 1 ml za pomocą probówki zagęszczającej o mocy 100 000 MWCO. Załadować zbiorczą próbkę do probówki zagęszczającej i odwirowywać przy 750 x g przez 15 minut w temperaturze 4 °C i powtarzać, aż całe eluowane białko zostanie zagęszczone do końcowej objętości około 0,5-1 ml.
      nuta: Taka wielkość porów pozwala na zatrzymanie cząsteczek miozyny, których masy są kilkakrotnie większe niż granica masy cząsteczkowej. Łańcuchy lekkie pozostają ściśle związane z domenami motorycznymi w tym czasie koncentracji, co zostało zweryfikowane poprzez wykonanie elektroforezy żelowej SDS-PAGE na produkcie końcowym.
4. Dializy i błyskawiczne zamrażanie
   1. Przygotować 2 l buforu do dializy, jak opisano w Tabeli 1. Załadować próbkę do worka lub komory dializacyjnej i dializować przez noc w chłodni.
      nuta: W przypadku M5a-HMM, po całonocnej dializie, białko będzie wystarczająco czyste, aby można je było wykorzystać w kolejnych testach. W razie potrzeby można przeprowadzić dalsze etapy oczyszczania, takie jak filtracja żelowa lub chromatografia jonowymienna.
5. Odzyskiwanie miozyny po dializie
   1. W przypadku M5a-HMM należy ostrożnie pobrać całą próbkę z komory dializacyjnej i odwirować w temperaturze 4 °C przez 15 minut przy 49 000 x g, w przypadku obecności jakichkolwiek niepożądanych agregatów. Weź supernatant.
6. Oznaczanie stężenia i błyskawiczne zamrażanie
   1. Aby określić stężenie produktu, należy zmierzyć absorbancję za pomocą spektrofotometru przy długościach fal 260, 280, 290 i 320 nm. Obliczyć stężenie w mg/ml (c_mg/ml) za pomocą równania 1, gdzie A₂₈₀ oznacza absorpcję przy 280 nm, a A₃₂₀ oznacza absorpcję przy 320 nm. Wynikowe stężenie w mg / ml można przeliczyć na μM cząsteczek miozyny za pomocą równania 2, gdzie M jest masą cząsteczkową całego białka (w tym łańcuchów ciężkich, łańcuchów lekkich, fluoroforów i wszystkich znaczników).
      c_mg/ml = (A₂₈₀ - A₃₂₀) / ε (1)
      Cząsteczki μM = 1000_{c mg/ml}/M (2)
      nuta: Jeśli konieczne jest rozcieńczenie, należy to zrobić w buforze o wysokiej sile jonowej. Współczynnik ekstynkcji (ε) można określić, importując sekwencję aminokwasową białka do programu takiego jak ExPASy. Typowa wydajność M5a-HMM wynosi około 0,5-1 ml białka 1-5 mg/ml. Współczynnik ekstynkcji dla M5a-HMM użyty w tej pracy wynosił 0,671.
   2. Oczyszczoną miozynę należy przechowywać na jeden z dwóch sposobów. Podwielokrotność podamy od 10 do 20 μl do cienkościennej probówki, takiej jak probówka do polimeryzacji w procesie reakcji łańcuchowej, i wrzuć probówkę do pojemnika z ciekłym azotem w celu błyskawicznego zamrożenia. Alternatywnie, bezpośrednio odpipetować od 20-25 μl miozyny do ciekłego azotu i przechowywać zamrożone kulki białka w sterylnych probówkach kriogenicznych. W obu przypadkach powstałe probówki można przechowywać w temperaturze -80 °C lub ciekłym azocie do wykorzystania w przyszłości.
      nuta: Ponieważ opisany poniżej test ruchliwości wymaga bardzo małych ilości białka, przechowywanie w małych porcjach, jak opisano, jest ekonomiczne.

2. Test TIRF dla pojedynczych cząsteczek

1. Przygotowanie szkiełek nakrywkowych
   1. Podzielić podstawowy proszek na 10 mg podwielokrotności (w probówkach 1,5 ml) metoksy-Peg-silanu (mPEG) i 10 mg podwielokrotności biotyny-Peg-silanu (bPEG). Przechowywać w temperaturze -20 °C w szczelnym, odtłuszczonym pojemniku i zużyć w ciągu 6 miesięcy.
   2. Załaduj osiem kwadratowych szkiełek nakrywkowych nr 1,5 H (wysoka precyzja) o grubości 22 mm na stojak i umyj 2-5 ml 200-procentowego etanolu, a następnie 2-5 ml wody destylowanej. Powtórz ten krok prania, kończąc na wodzie. Następnie całkowicie wysusz szkiełka nakrywkowe za pomocą przewodu powietrznego lub N₂ i wyczyść plazmowo argonem przez 3 minuty.
   3. Umieścić czyste szkiełka nakrywkowe na bibule filtracyjnej (90 mm) w naczyniu do hodowli tkankowych (100 x 20 mm) i inkubować w piecu o temperaturze 70 °C, wykonując następujące czynności.
      UWAGA: Czyszczenie plazmowe można zastąpić innymi metodami czyszczenia chemicznego.
   4. Przygotować 80% roztwór etanolu z_dH2O i dostosować pH do 2,0 za pomocą HCl. Dodać 1 ml tego roztworu do 10 mg podwielokrotności mPEG i 1 ml do 10 mg podwielokrotności bPEG. Wir do rozpuszczenia, który nie powinien trwać dłużej niż 30 s.
   5. Weź 100 μl roztworu bPEG i dodaj 900 μl 80% etanolu (pH 2,0). Ten roztwór to 1 mg/ml bPEG. Następnie przygotuj roztwór obu PEG-ów w następujący sposób, dokładnie mieszając.
      1. 200 μL 10 mg/ml mPEG (stężenie końcowe: 2 mg/mL).
      2. 10 μl 1 mg/ml bPEG (stężenie końcowe: 10 μg/ml).
      3. 790 μl 80% roztworu etanolu (pH 2,0).
   6. Wyjmij szkiełka nakrywkowe z piekarnika. Ostrożnie dozować 100 μl roztworu PEG na środek każdego szkiełka nakrywkowego, upewniając się, że mokra jest tylko górna powierzchnia. Następnie włóż zrazy z powrotem do piekarnika i inkubuj przez 20 do 30 minut.
   7. Kiedy szkiełka nakrywkowe zaczną nabierać dziurawego wyglądu, z małymi kółkami widocznymi na powierzchni, wyjmij je z piekarnika.
   8. Umyj każde szkiełko nakrywkowe 100% etanolem, wysusz przewodem powietrznym i włóż z powrotem do piekarnika. Inkubować tylko przez czas wymagany do stworzenia komór w kroku 2.
2. Przygotowanie komory
   1. Wyczyść szkiełko mikroskopowe do użycia w komorze . Wytnij dwa kawałki taśmy dwustronnej o długości około 2 cm.
   2. Umieść jeden kawałek wzdłuż środka dłuższej krawędzi szkiełka mikroskopowego. Upewnij się, że krawędź taśmy jest wyrównana z krawędzią suwaka. Umieść drugi kawałek taśmy około 2 mm poniżej pierwszego kawałka taśmy, tak aby oba były równoległe i wyrównane.
   3. Weź jedno z funkcjonalnych szkiełek nakrywkowych z piekarnika (utworzone w 2.1). Ostrożnie przyklej szkiełko nakrywkowe do taśmy tak, aby strona pokryta PEG była skierowana w dół i stykała się bezpośrednio z taśmą, jak pokazano na rysunku 1. Za pomocą końcówki do pipet delikatnie dociśnij złącze taśmy ślizgowej, aby upewnić się, że szkiełko nakrywkowe prawidłowo przylega do szkiełka.
   4. Odetnij nadmiar taśmy zwisającej nad zjeżdżalnią za pomocą żyletki. Komory te mogą być używane natychmiast lub umieszczone parami w probówce o pojemności 50 ml i przechowywane w zamrażarce o temperaturze -80 °C do wykorzystania w przyszłości. Ważne jest, aby przechowywać natychmiast , w przeciwnym razie powierzchnia ulegnie degradacji.
3. Wykonanie testu mikroskopowego miozyny 5a TIRF
   1. Przygotować roztwory do testu odwróconej ruchliwości miozyny 5a opisanego w Tabeli 2 i przechowywać je na lodzie.
   2. Umyj komorę 10 μl 50 mM MB za pomocą 1 mM DTT.
   3. Przepływ w 10 μl 1 mg/ml BSA w 50 mM MB z 1 mM DTT. Powtórz to pranie jeszcze dwa razy i odczekaj 1 minutę po trzecim praniu. Użyj rogu bibuły lub bibuły filtracyjnej, aby przesączyć roztwór przez kanał.
   4. Umyć 10 μl 50 mM MB z 1 mM naziemnej telewizji cyfrowej. Powtórz to pranie jeszcze dwa razy.
   5. Przepłynąć 10 μL roztworu NeutrAwidin w 50 mM MB z 1 mM DTT i odczekać 1 min.
   6. Umyć 10 μl 50 mM MB z 1 mM naziemnej telewizji cyfrowej. Powtórz to pranie jeszcze dwa razy.
   7. Przelej 10 μL biotynylowanej aktyny rodaminy (bRh-aktyny) zawierającej 1 mM DTT w 50 mM MB i odczekaj 1 min. Na tym etapie należy użyć końcówki do pipet o dużym otworze i unikać pipetowania w górę i w dół, aby zminimalizować ścinanie fluorescencyjnych włókien aktynowych, aby zapewnić możliwość przymocowania długich włókien aktynowych do powierzchni (20-30 μm lub więcej). Skuteczną alternatywą jest przecięcie stożka standardowej końcówki pipety (o otworze ≈1-1,5 mm).
   8. Umyć 10 μl 50 mM MB z 1 mM naziemnej telewizji cyfrowej. Powtórz to pranie jeszcze dwa razy.
   9. Przelej 30 μl końcowego buforu z dodaną miozyną 5a 10 nM, a następnie natychmiast załaduj do mikroskopu TIRF i zapisz po znalezieniu optymalnej ostrości dla metody obrazowania TIRF. Czasy ekspozycji między 100-200 ms są odpowiednie przy mocy lasera 1,4 mW dla aktyny i miozyny znakowanej GFP. Odpowiedni czas akwizycji do analizy prędkości to 3 min.

Tabela 1: używane do oczyszczania białek.

Nazwa bufora	kompozycja	Zastosowane kroki	Komentarze
Bufor ekstrakcji M5a	0,3 mln NaCl	1.1	Trzymaj się lodu.
	MOPS 15 mM, pH 7,2
	15 mM MgCl2
	1,5 mM EGTA
	4,5 mM NaN3
Bufor A	0,5 mln NaCl	2.2	Trzymaj się lodu.
	MOPS 10 mM, pH 7,2
	0,1 mM EGTA
	3 mM NaN3
	1 mM ATP
	1 mM naziemna telewizja cyfrowa
	5 mM MgCl2
Bufor B	0,5 mln NaCl	2.3	Trzymaj się lodu.
	MOPS 10 mM, pH 7,2
	0,1 mM EGTA
	3 mM NaN3
	1 mM naziemna telewizja cyfrowa
Bufor elucji	0,5 mln NaCl	3.1	Trzymaj się lodu.
	0,5 mg/ml peptyd FLAG
	MOPS 10 mM, pH 7,2
	0,1 mM EGTA
	3 mM NaN3
	Odczyn pH 7,2
>Bufor dializacyjny M5a	500 mM KCl	4.1	Użyj zimnego dH2O, aby zwiększyć głośność.
	10 mM MgCl2
	MOPS 10 mM, pH 7,2
	0,1 mM EGTA
	1 mM naziemna telewizja cyfrowa

Tabela 2: stosowane w teście TIRF.

Nazwa bufora	kompozycja	Zastosowane kroki	Komentarze
4X Bufor ruchliwości (4X MB)	MOPS 80 mM, pH 7,2		Filtruj próżniowo i przechowuj w temperaturze 4°C
	20 mM MgCl2
	0,4 mM EGTA
	Odczyn pH 7,4
>50 mM bufor ruchliwości soli (50 mM MB)	25% v/v 4X MB		Filtruj próżniowo i przechowuj w temperaturze 4°C
	50 mM KCl
	Zwiększyć głośność za pomocą dH2O
Bufor ruchliwości soli 150 mM (150 mM MB)			Filtruj próżniowo i przechowuj w temperaturze 4°C
Miozyna		Zobacz przepis na "Ostateczny bufor"	Trzymaj na lodzie.
2 mg/ml NeutrAwidyny	2 mg/ml NeutrAwidyna	3.5	Trzymaj się lodu.
	1 mM naziemna telewizja cyfrowa
	Rozcieńczyć w 50 mM MB
1 mg/ml albuminy surowicy bydlęcej (BSA)	1 mg/ml masy ciała	3.3	Trzymaj się lodu.
	1 mM naziemna telewizja cyfrowa
	Rozcieńczyć w 50 mM MB
200 nM rodamina-falloidyna biotynylowana F-aktyna (bRh-aktyna)	200 nM rodamina-falloidyna biotynylowana F-aktyna	3.7	Unikaj ścinania, nie wirując ani nie pipetując w górę i w dół. Aby wymieszać, delikatnie odwróć.
	1 mM naziemna telewizja cyfrowa
	Rozcieńczyć w 50 mM MB
MB z naziemną obsługą naziemną	50 mM naziemna telewizja cyfrowa	3.2, 3.4, 3.6, 3.8	Trzymaj się lodu.
	Rozcieńczyć w 50 mM MB
Końcowy bufor	50 mM KCl	3.9	Dodaj glukozę, oksydazę glukozową i katalazę bezpośrednio przed przeprowadzeniem eksperymentu. Trzymaj na lodzie.
	MOPS 20 mM, pH 7,2
	5 mM MgCl2
	0,1 mM EGTA
	1 mM ATP
	50 mM naziemna telewizja cyfrowa
	1 μM kalmodulina
	2,5 mg/ml glukozy
	100 μg/ml oksydazy glukozowej
	40 μg/ml katalazy
	10 nM miozyny

Wyniki

Rysunek 1: Przygotowanie funkcjonalizowanych komór przepływowych.(A) Zacznij od oczyszczonego szkiełka mikroskopowego, dwóch kawałków taśmy dwustronnej przyciętych na około 2 cm i funkcjonalnego szkiełka nakrywkowego. (B) Dodaj taśmę do środka szkiełka mikroskopowego. (C) Przymocuj szkiełko nakrywkowe do taśmy powłoką skierowaną w dół i delikatnie d...

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
2 M roztwór MgCl2	Firma VWR	Numer katalogowy: 10128-298
5 M roztwór NaCl	Firma KD Medical	RGE-3270
kwas octowy	ThermoFisher Naukowy	984303
Żel powinowactwa Anti-FLAG M2	Millipore Sigma	A2220	https://www.sigmaaldrich.com/content/dam/sigma-aldrich/docs/Sigma/Bulletin/a2220bul.pdf
Atp	Millipore Sigma	A7699
Biotynylowana G-aktyna	Cytoszkielet, Inc.	Zobacz materiał AB07
Albumina surowicy bydlęcej	Millipore Sigma	Numer katalogowy: 5470
bPEG-silan	Laysan Bio, Inc	Biotyna-PEG-SIL-3400-1g
Koncentrat odczynnika Bradford	Bio-Rad	5000006
Kalmodulina		PMID: 2985564
Katalazy	Millipore Sigma	Zobacz materiał C40
Linia komórkowa (Sf9) w SF-900 II SFM	ThermoFisher Naukowy	11496015	http://tools.thermofisher.com/content/sfs/manuals/bevtest.pdf https://tools.thermofisher.com/content/sfs/manuals/bactobac_man.pdf
Okrągła bibuła filtracyjna - test odwrócony	Millipore Sigma	WHA1001090
Kompletne, wolne od EDTA tabletki z inhibitorem proteazy	Millipore Sigma	5056489001	Powinien on być przechowywany w temperaturze 4 °C. Tabletki mogą być używane bezpośrednio lub mogą być rozpuszczone w postaci 25-krotnego roztworu podstawowego, rozpuszczając 1 tabletkę w 2 ml wody destylowanej. Otrzymany roztwór można przechowywać w temperaturze 4 °C przez 1-2 tygodnie lub co najmniej 12 tygodni w temperaturze -20 °C.
Rury koncentracyjne (100 000 MWCO)	Korporacja EMD Millipore	UFC910024	MWCO probówki niekoniecznie jest "uniwersalny", o ile MWCO jest mniejsze niż całkowita masa cząsteczkowa oczyszczanego białka. M5a został skoncentrowany za pomocą lampy o mocy 30 000 MWCO.
Barwnik Coomassie Brilliant Blue R-250	ThermoFisher Naukowy	Numer katalogowy: 20278
Stojak na szkiełka nakrywkowe	Millipore Sigma	Z688568-1EA
Szkiełka nakrywkowe: test odwróconej ruchliwości	Azer Naukowy	ES0107052
Rurki do dializy (3500 daltonów MCWO)	Fischer Naukowy	08-670-5A	Średnica rurki dializacyjnej może się różnić, ale MWCO powinno być takie samo. Probówki można przechowywać w 20% roztworze alkoholu w temperaturze 4 °C.
DL-ditiotreitol	Millipore Sigma	D0632
Taśma dwustronna	Magazyn biurowy	909955
Peptyd DYKDDDDK	Język GenScript	RP10586	Można go rozpuścić w buforze zawierającym 0,1 M NaCl, 0,1 mM EGTA, 3 mM NaN3 i 10 mM MOPS (pH 7,2) do końcowego stężenia 50 mg/ml. Można go przechowywać w temperaturze -20 °C jako podwielokrotności 300 μl.
EGTA (EGTA)	Millipore Sigma	E4378
Kolumna elucyjna	Bio-Rad	Nr kat. 761-1550	Można je ponownie wykorzystać. Aby wyczyścić, przepłucz kolumnę 2-3 objętościami PBS i wodą destylowaną. Przed użyciem schłodzić kolumnę w temperaturze 4°C.
etanol	Fischer Naukowy	Certyfikat A4094
glukoza	Millipore Sigma	Kontroler G8270
Oksydaza glukozowa	Millipore Sigma	Zobacz materiał G2133
Roztwór buforowy glicyny, 100 mM, pH 2-2,5, 1 l	Biotechnologia Santa Cruz	SC-295018
Hcl	Millipore Sigma	320331
Kcl	Fischer Naukowy	Zobacz materiał P217-500
Końcówki do pipet z dużym otworem	Fischer Naukowy	Numer katalogowy: 02-707-134
Inhibitor proteazy leupeptyny	ThermoFisher Naukowy	Numer telefonu 78435
Mark12 Nieplamiona drabina standardowa	ThermoFisher Naukowy	LC5677
metanol	Millipore Sigma	MX0482
Szkiełka mikroskopowe	Fischer Naukowy	Numer katalogowy: 12-553-10
Mopy	Fischer Naukowy	Zobacz materiał BP308-100
mPEG-silan	Laysan Bio, Inc	MPEG-SIL-2000-1g
NaN3	Millipore Sigma	Zobacz materiał S8032
NeutrAwidyna	ThermoFisher Naukowy	Numer katalogowy: 31050
NuPAGE 4 do 12% Bis-Tris Mini żel białkowy, 15-dołkowy	ThermoFisher Naukowy	NP0323PK2
Bufor próbki NuPAGE LDS (4X)	ThermoFisher Naukowy	NP0007
sól fizjologiczna buforowana fosforanami, pH 7,4	ThermoFisher Naukowy	10010023
PMSF (Kanał PMSF)	Millipore Sigma	Numer telefonu 78830	PMSF może być wytwarzany w postaci 0,1 M roztworu podstawowego w izopropanolu i przechowywany w temperaturze 4 °C. Dodanie izopropanolu powoduje wytrącanie się kryształów, które można rozpuścić przez mieszanie w temperaturze pokojowej. Bezpośrednio przed użyciem PMSF można dodawać kroplami do szybko mieszającego roztworu do końcowego stężenia 0,1 mM.
Żyletki	Magazyn biurowy	397492
Rodamina-falloidyna	ThermoFisher Naukowy	Czynnik chłodniczy R415	Bulion można rozcieńczyć w 100% metanolu do końcowego stężenia 200 μM.
Nośniki SF9	ThermoFisher Naukowy	Numer katalogowy: 12658-027	Powinien być przechowywany w temperaturze 4°C. Jego okres trwałości wynosi 18 miesięcy od daty produkcji.
Naczynie do hodowli tkankowych - test odwrócony	Corning	353003	Każde naczynie do hodowli tkankowej może pomieścić około czterech szkiełek nakrywkowych.
Końcówki do pipet o gładkich ściankach 200 μl	Thomas Naukowy	Numer katalogowy: 1158U38
sprzęt
wirówka	ThermoFisher Naukowy	75006590
mikroskop	Nikon	Model: Eclipse Ti z systemem H-TIRF z obiektywem 100x TIRF (brak 1,49)
Kamera mikroskopowa	Andor	Model: Kamera iXon DU888 EMCCD (format czujnika 1024 x 1024)
Mikroskopowa skrzynka kontrolna	HIT Tokai	Niestandardowy Thermobox
Jednostka laserowa mikroskopu	Nikon	Czteroczęściowy zespół laserowy LU-n4 z laserami półprzewodnikowymi dla 405 nm, 488 nm, 561 nm i 640 nm
Wirówka środkowa	ThermoFisher Naukowy	Modelu: CR3i
Dźwiękowiec Misonix	Misonix (Język misonix	XL2020
Ultrawirówka stołowa Optima Max-XP	Beckman Coulter	393315
Czyściciel plazmowy	Diener electronic GmbH + Co. KG	Typ systemu: Zepto
Sonda sonicyjna (3,2 mm)	Qsonica powiedział:	Numer katalogowy: 4418
Standardowy inkubator	spoiwo	Modelka: 56
Mikser rurowy Waverly	Waverly	TR6E

powiedział: (wersja angielska) powiedział: powiedział: powiedział: TGL powiedział: powiedział: powiedział: powiedział: środowiska ) powiedział: