Humanizowany test uwalniania enzymu mediatorowego: immunochemiczna metoda badania potencjału alergicznego antygenu testowego poprzez monitorowanie odpowiedzi degranulacji bazofili in vitro

Abstract

Źródło: Wenger, M. et al. Humanizowany test uwalniania mediatora jako odczyt siły działania alergenów. J. Vis. Exp. (2021)

W tym filmie opisujemy metodę in vitro do oceny potencjału alergicznego antygenu do wywołania degranulacji bazofilów. β-heksosaminidaza jest używana jako wskaźnik uwalniania chemicznego mediatora, a aktywność enzymatyczna β-heksosaminidazy jest mierzona za pomocą substratu fluorogenicznego.

Protocol

Wszystkie procedury z udziałem ludzi zostały przeprowadzone zgodnie z instytucjonalnymi, krajowymi i międzynarodowymi wytycznymi dotyczącymi dobrobytu ludzi i zostały sprawdzone przez lokalną komisję rewizyjną instytucji.

1. Pasywne uczulenie komórek huRBL

1. Odwirować wstępnie inkubowaną zawiesinę Ag8/surowicy przez 5 minut przy 250 x g.
2. Przenieść 50 μl odwirowanej zawiesiny Ag8/surowicy do każdej studzienki zawierającej komórki huRBL, nie naruszając osadu komórek Ag8.
   1. Uwzględnij kontrolę bez antygenu, które są uwrażliwionymi, ale niestymulowanymi komórkami (nie dodawaj antygenu), służąc jako wskazan....

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
4-metylobebelliferyl N-acetylo-β-D-glukozaminid	Sigma	Zobacz materiał M2133
Płytka 96-dołkowa do komórek huRBL (Nunc MicroWell 96-Well, Nunclon Deltatreated, mikropłytka z płaskim dnem)	ThermoFisher Naukowy	167008
96-dołkowa płytka do roztworu substratu i supernatantu komórkowego (96-dołkowe płytki Greiner BioOne bez obróbki)	Fisher Naukowy	655101
Albumina surowicy bydlęcej (BSA)	Sigma	10735078001
Kwas cytrynowy	Aplikacja	131018
glicyna	Aplikacja	A3707
Chlorek sodu (NaCl)	Aplikacja	Nr kat. A2942
Wodorowęglan sodu (NaHCO3)	Aplikacja	131638
Tryton X-100	Sigma	Silnik X100
Sól tyrodejska	Sigma	Zobacz materiał T2145