$$\rightleftharpoonup{xx}$$
$$\longleftharp{xx}$$,
$$\longrightharp{xx}$$,
Wszystkie procedury z udziałem ludzi zostały przeprowadzone zgodnie z instytucjonalnymi, krajowymi i międzynarodowymi wytycznymi dotyczącymi dobrobytu ludzi i zostały sprawdzone przez lokalną komisję rewizyjną instytucji.
1. Pasywne uczulenie komórek huRBL
- Odwirować wstępnie inkubowaną zawiesinę Ag8/surowicy przez 5 minut przy 250 x g.
- Przenieść 50 μl odwirowanej zawiesiny Ag8/surowicy do każdej studzienki zawierającej komórki huRBL, nie naruszając osadu komórek Ag8.
- Uwzględnij kontrolę bez antygenu, które są uwrażliwionymi, ale niestymulowanymi komórkami (nie dodawaj antygenu), służąc jako wskazanie dla dolnego plateau sygnałowego / tła. Studzienki kontrolne tła i maksymalnej lizy nie muszą być uwrażliwiane surowicą. Zamiast tego dodaj 50 μl pożywki huRBL do studzienek kontrolnych.
- Przykryj płytkę pokrywką i inkubuj przez noc w temperaturze 37 °C i 5%-7% CO2 .
2. Degranulacja stymulowana antygenem i uwalnianie mediatora
- Przygotować wcześniej rozcieńczenie antygenu w 1x buforze Tyrode'a (9,5 g/l soli Tyrode'a, 0,1% albuminy surowicy bydlęcej (BSA), 0,5 g/l wodorowęglanu sodu (NaHCO3) w dH2O). Potrzebna jest końcowa ilość 100 μl na studzienkę.
nuta: Nie każdy alergen, zarówno oczyszczony z naturalnych źródeł, jak i wyprodukowany rekombinacyjnie, może być stabilny w buforze 1x Tyrode. Dlatego przed procedurą testową należy przeprowadzić testy stabilności w buforze 1x Tyrode. Alternatywnie, rozcieńczyć 1x bufor Tyrode'a w tlenku deuteru (D2O), aby zwiększyć stosunek sygnału do szumu w teście.
- Wykonać 8 rozcieńczeń interesującego antygenu z serii rozcieńczeń 1:10 w probówkach reakcyjnych, zaczynając od 10 lub 1 μg/ml białka.
UWAGA: Zawsze należy wcześniej przetestować serię rozcieńczeń. Alternatywnie można dostosować serię rozcieńczeń 1:10 (np. 1:5, 1:20 lub 1:30), aby pokryć pełną krzywą uwalniania. Ponadto stężenie początkowe może się różnić w zależności od konfiguracji eksperymentalnej.
- Aby umyć komórki huRBL posiane na płytce 96-dołkowej, należy najpierw usunąć pożywkę komórkową zawierającą surowice, ostrożnie zasyszając, odwracając i stukając płytką w papier chłonny.
- Przemyć komórki 200 μl 1x buforu Tyrodes na studzienkę. Traktuj wszystkie studzienki podobnie.
nuta: Powoli dodawaj roztwór myjący do komórek, aby im nie przeszkadzać.
- Pozostaw na około 30 s i powtórz krok prania w sumie trzy razy.
- Po dodaniu roztworu myjącego po raz ostatni, pozostaw roztwór w studzienkach, aż będzie gotowy do dalszego dodawania rozcieńczania antygenu.
nuta: Unikaj wystawiania komórek na działanie powietrza zbyt długo.
- Przenieść 100 μl roztworu antygenu do każdej studzienki zawierającej wstępnie uczulone komórki huRBL.
UWAGA: W przypadku analizy kilku różnych parametrów należy przenieść poszczególne próbki z serii rozcieńczeń na dodatkową niewiążącą płytkę 96-dołkową (użyć tego samego układu, co na płytce huRBL), a następnie przenieść je za pomocą pipety wielokanałowej bezpośrednio na płytkę kuwety huRBL. W ten sposób można uniknąć zbyt długiego wystawiania komórek na działanie powietrza, co może skutkować słabą wydajnością testu (niższy sygnał / jego brak).
- Przykryj studzienki kontrolne (maksymalna liza i nieuczulone komórki tła) 100 μl 1x buforu Tyrode. Nie należy stymulować tych studzienek kontrolnych antygenem.
- Dodatkowo dodać 100 μl buforu 1x Tyrode'a do uczulonych studzienek bez antygenu z serii rozcieńczeń, co jest potrzebne do uwzględnienia niezależnego od antygenu spontanicznego uwalniania uczulonych komórek podczas analizy danych.
- Inkubować komórki huRBL przez 1 godzinę w temperaturze 37 °C i 5%-7% CO2 .
3. Pomiar fluorescencji aktywności β-heksozaminidazy
- Studzienki o maksymalnej kontroli lizy należy potraktować 10 μl 10% Triton X-100 na studzienkę i odpowiednio wymieszać, aby całkowicie zlizować komórki i uzyskać 100% uwolnienie β-heksosaminidazy.
- Dodać 50 μl roztworu substratu do nowej, niewiążącej płytki 96-dołkowej. Roztwór substratu dla jednej płytki 96-dołkowej: 5 ml 0,1 M buforu do oznaczania cytrynowego, pH 4,5; i 80 μl 10 mM N-acetylo-β-D-glukozaminidu 4-metyloumbelirylu.
- Przenieść 50 μl supernatantu komórkowego ze wszystkich studzienek na nową płytkę zawierającą roztwór substratu.
UWAGA: Ostrożnie odpipetować supernatant z płytki huRBL, aby nie zakłócić działania komórek huRBL.
- Inkubować płytkę z roztworem substratu i supernatantem komórkowym przez 1 godzinę w temperaturze 37 °C, aby umożliwić konwersję substratu fluorogenicznego.
nuta: Zachowaj płytkę huRBL do testu żywotności komórek.
- Dodać 100 μl roztworu zatrzymującego (15 g/l glicyny, 11,7 g/l NaCl rozpuszczony wdH2O, pH 10,7) do dołka.
- Zmierzyć fluorescencję przy wzbudzeniu 360 nm i emisji 465 nm za pomocą czytnika płytkowego.