$$\rightleftharpoonup{xx}$$
$$\longleftharp{xx}$$,
$$\longrightharp{xx}$$,
1. Wysokoprzepustowe badania przesiewowe (HTS) w kierunku zahamowania wzrostu
UWAGA: Aktywność hamująca wzrost środków przeciwnowotworowych przeciwko organoidom nowotworowym (PDO) pochodzącym od pacjenta jest oceniana poprzez pomiar wewnątrzkomórkowej zawartości ATP, jak pokazano na rysunku 1. Ten etap jest wykonywany przy użyciu dostępnego na rynku zestawu do oznaczania żywotności komórek (patrz tabela materiałów).
- W dniu 0 należy przeprowadzić hodowlę ChNP (np. RLUN007) w kolbach do momentu, aż dostępna będzie odpowiednia liczba skupisk komórek do testu. Na jeden dzień przed wysiewem przenieść zawiesinę ChNP z kolby o średnicy 75cm2 do probówki o pojemności 15 ml i odwirować przy 200 x g przez 2 minuty w celu zmierzenia objętości granulatu PDO. Następnie ponownie zawiesić granulki ChNP w 15 ml świeżej pożywki i przenieść je z powrotem do kolby o długości75 cm2. Hodowla komórek w temperaturze 37 °C w 5% CO2,
nuta: Wymagana objętość osadu PDO zależy od stopnia rozcieńczenia każdej ChNP i liczby 384-dołkowych płytek użytych do testu. W przypadku RLUN007 do wysiewu na dziesięć płytek 384-dołkowych niezbędne jest 200 μl objętości osadu komórkowego.
- W dniu 1 (24 godziny po zmianie pożywki) zmielić ChNP za pomocą sprzętu do fragmentacji i dyspersji komórek (patrz tabela materiałów) z uchwytem filtra zawierającym filtr siatkowy o wielkości 70 μm. Następnie rozcieńczyć 15 ml zawiesiny ChNP 10x. Wysiewać 40 μl zawiesiny ChNP na 384-dołkowe mikropłytki sferoidalne (okrągłodenne) o bardzo niskim przyleganiu (patrz Tabela materiałów) za pomocą dozownika zawiesiny komórek (patrz Tabela materiałów).
nuta: Do mielenia klastrów komórek zaleca się stosowanie dostępnych na rynku urządzeń do fragmentacji i dyspersji komórek (patrz tabela materiałów).
- Po 24 godzinach od wysiewu (dzień 2) należy potraktować PDO 0,04 μl roztworów badanego czynnika w końcowym zakresie stężeń od 20 μM do 1,0 nM (10 seryjnych rozcieńczeń) przy użyciu płynu (patrz tabela materiałów).
- W dniu 8 (144 godziny po poddaniu działaniu substancji badanej) dodać wewnątrzkomórkowy odczynnik pomiarowy ATP do studzienek testowych. Wymieszać płytki za pomocą mieszadła i inkubować przez 10 minut w temperaturze 25 °C. Zmierzyć wewnątrzkomórkową zawartość ATP jako luminescencję za pomocą czytnika płytek (patrz Tabela materiałów).
- Aby obliczyć żywotność komórek, należy podzielić ilość ATP w studzienkach testowych przez ilość w studzienkach kontrolnych zawierających nośnik, odejmując tło. Aby obliczyć szybkość wzrostu w ciągu 6 dni, należy podzielić ilość ATP w studzienkach kontrolnych pojazdu przez ilość w studzienkach kontrolnych pojazdu 24 godziny po wysiewie.
- Obliczyć 50% stężenie hamujące (IC50) i wartości pola pod krzywą (AUC) na podstawie krzywych dawka-odpowiedź, korzystając z oprogramowania do analizy danych biologicznych (patrz tabela materiałów). Współczynnik Z jest parametrem bezwymiarowym, który mieści się w zakresie od 1 (nieskończona separacja) do <0, zdefiniowanym jako Z = 1 - (3σc+ + 3σc-) / |μc+ - μc-|, gdzie σc+, σc-, μc+ i μc- są odchyleniami standardowymi (σ) i średnimi (μ) regulatorów wysokiego (c+) i niskiego (c−), odpowiednio.
