1. Przygotowanie lizatów całokomórkowych
- Zaszczepić szczepy kolekcjonerskie E. coli K-12 ASKA ORFeome w 1,5 ml bulionu lizogenicznego (LB) zawierającego 25 μg/ml chloramfenikolu w 96-dołkowych płytkach głębokich. Rosnąć przez noc (O/N) przez 18 godzin w temperaturze 30 °C z wytrząsaniem przy 160 obr./min. Następnego dnia dodać izopropylowy β-d-1-tiogalaktopiranozyd (IPTG) (końcowe 0,5 mM) do kultur O/N w celu wywołania ekspresji białka w temperaturze 30 °C przez 6 godzin.
- Granulki rozdrabniać do 500 x g przez 10 min. Zamrażać granulki w temperaturze -80 °C do momentu użycia. Aby lizować komórki, dodaj 150 μl buforu do lizy L1 (40 mM Tris pH 7,5, 100 mM NaCl, 10 mM MgCl2, uzupełnione 2 mM fluorkiem fenylometylosulfonylu (PMSF), 40 μg/ml DNazy 1 i 0,5 mg / ml lizozymu) w celu ponownego zawieszenia osadu.
- Zamrażać komórki w temperaturze -80 °C przez 30 minut, a następnie rozmrażać w temperaturze 37 °C przez 20 minut. Powtórzyć ten cykl trzy razy, aby dokonać lizy komórek. Przed użyciem lizaty przechowywać w temperaturze -80 °C.
2. Oczyszczanie Relseq i GppA
UWAGA: Rekombinowane białka Relseq ze Streptococcus equisimilis i GppA z E. coli K-12 są używane do syntezy znakowanych radioaktywnie pppGpp i ppGpp, odpowiednio.
- Hoduj i zbieraj komórki z nadekspresją każdego białka.
- Hodować szczep E. coli BL21 DE3 do fazy wykładniczej (gęstość optyczna (OD) ~0,3-0,4) w bulionie LB i odwirować 1 ml kultury przy 6000 x g przez 5 minut. Zdekantować supernatant i ponownie zawiesić komórki 100 μl lodowatego bulionu TSB (bulion LB uzupełniony 0,1 g / ml PEG3350, 0,05 ml / ml dimetylosulfotlenku, 20 mM MgCl2).
- Zmieszać plazmidy zawierające znakowane histydyną relseq i gppA, każdy o wielkości 100 ng, z powyższymi zawiesinami komórek w TSB i inkubować na lodzie przez 30 minut. Szok termiczny komórek w temperaturze 42 °C przez 40 s. Umieścić mieszaninę na lodzie na 2 minuty i dodać 1 ml bulionu LB w temperaturze pokojowej, aby umożliwić komórkom regenerację przez 1 godzinę w temperaturze 37 °C z mieszaniem przy 160 obr./min.
- Zebrane komórki ułożyć na płytkach agarowych LB uzupełnionych odpowiednimi antybiotykami (Relseq: 100 μg/ml ampicyliny; GppA: 30 μg/ml kanamycyny). Następnego dnia zaszczepić kolonie w bulionie LB, aby rozpocząć prekultury O/N obu szczepów w temperaturze 37 °C.
- Po 18 godzinach zaszczepić 500 ml pożywki LB 10 ml kultur O/N i odpowiednimi antybiotykami. Hodować kultury przez wytrząsanie z prędkością 160 obr./min w temperaturze 37 °C. Gdy OD600nm osiągnie 0,5-0,7, indukuj ekspresję białka, dodając 0,5 mM IPTG i rosnąc przez 3 godziny w temperaturze 30 °C z wytrząsaniem przy 160 obr./min.
- Zebrać komórki, wirując w temperaturze 6084 x g przez 10 minut w temperaturze 4 °C. Zawiesić osad w 20 ml lodowatego roztworu soli fizjologicznej buforowanej fosforanem (PBS) i ponownie odwirować przy 1912 x g przez 20 minut w temperaturze 4 °C. Przed użyciem zdekantować supernatant i zamrozić granulki w temperaturze -20 °C.
- Oczyszczanie powinowactwa do kwasu niklowo-nitrylotrioctowego (Ni-NTA)
nuta: Od tego momentu należy upewnić się, że próbki są zimne.
- Dodać 40 ml lodowatego buforu do lizy L2 (50 mM Tris pH 7,5, 150 mM NaCl, 5% glicerolu, 10 mM imidazolu, 10 mM β-merkaptoetanolu uzupełnionego inhibitorami proteazy (tabletka wolna od EDTA; patrz tabela materiałów) w celu ponownego zawieszenia osadu. Lizuj komórki za pomocą sonikacji (60% amplitudy, 2 s WŁ./ 4 s WYŁĄCZ przez 8 min WŁ.). Oczyścić lizat przez wirowanie w temperaturze 23,426 x g przez 40 minut w temperaturze 4 °C i kontynuować z supernatantem w celu oczyszczenia.
- Podczas powyższego wirowania przygotuj żywicę Ni-NTA.
- Przenieść 500 μl homogenizowanej żywicy Ni-NTA do stojącej kolumny do chromatografii polipropylenowej i pozostawić na 15 minut, a roztwór do przechowywania spłynie. Przemyć żywicę dwukrotnie 15 ml ultraczystej wody, a następnie przemyć kolumnę 15 ml buforu do lizy L2.
- Załadować oczyszczony supernatant lizatu komórkowego z kroku 1 do kolumny i pozwolić mu przepłynąć. Przepłukać kolumnę 30 ml buforu płuczącego (50 mM Tris pH 7,5, 150 mM NaCl, 5% glicerolu, 20 mM imidazolu).
- Trzykrotnie eluować białka za pomocą 400 μl buforu elucyjnego (50 mM Tris pH 7,5, 150 mM NaCl, 5% glicerolu, 500 mM imidazolu). Następnie powtórzyć elucję z kolejnymi 300 μl buforu elucyjnego. Połączyć eluowane białka do końcowej objętości 700 μl.
- Filtracja żelowa
- Przygotować żelowy bufor filtracyjny (50 mM Tris, pH 7,5; 200 mM NaCl; 5% glicerolu). Przemyć kolumnę wykluczającą wielkość jedną objętością kolumny (25 ml) żelowego buforu filtracyjnego.
- Załadować powyższą próbkę o objętości 700 μl za pomocą pętli o pojemności 500 μl, uruchomić z prędkością 0,5 ml/min i zebrać 2-3 frakcje, każda o objętości 0,5 ml, zawierające odpowiednie białka.
- Połączyć i zagęścić frakcje zawierające każde z białek za pomocą kolumny wirowej i zmierzyć stężenie białka za pomocą testu Bradforda.
3. Synteza 32pppGpp i ppGpp znakowanych P
- Przeprowadzić reakcję Relseq na małą skalę w probówce z nakrętką (patrz Tabela 1).
nuta: Pracuj z odczynnikami promieniotwórczymi tylko w licencjonowanym miejscu i przy użyciu środków ochrony osobistej.
- Inkubować probówkę w temperaturze 37 °C w termomikserze przez 1 godzinę, następnie w temperaturze 95 °C przez 5 minut i umieszczać na lodzie przez 5 minut. Odwirować wytrącone białko w temperaturze 15 700 x g przez 5 minut i przenieść supernatant (zsyntetyzowany 32P-pppGpp) do nowej probówki z nakrętką.
- Aby zsyntetyzować 32P-ppGpp z 32P-pppGpp, przenieś połowę produktu 32P-pppGpp do nowej probówki z nakrętką i dodaj 1 μM GppA. Inkubować probówkę w temperaturze 37 °C przez 10 minut, w temperaturze 95 °C przez 5 minut, a następnie umieścić na lodzie na 5 minut.
- Odwirować wytrącone białko w ilości 15 700 x g przez 5 minut i przenieść supernatant (zsyntetyzowany 32P-ppGpp) do nowej probówki z nakrętką.
- Analizować 32P-pppGpp i 32P-ppGpp, umieszczając 1 μl próbek na płytce do chromatografii cienkowarstwowej (TLC) (płytki TLC z celulozy modyfikowanej polietylenopinaminą) przy użyciu 1,5 M KH2PO4, pH 3,4, jako fazy ruchomej.
nuta: Użyj 5'-trifosforanu guanozyny znakowanego α-32P (32P-α-GTP) jako kontroli.
- Całkowicie wysusz płytkę TLC, umieść ją między przezroczystym plastikowym folderem i wystaw na ekran luminoforowy do przechowywania przez 5 minut. Wizualizacja i kwantyfikacja sygnałów za pomocą phosphorimager.
nuta: Gdy proporcje 32P-pppGpp i 32P-ppGpp są wyższe niż 85%, można zebrać i zsyntetyzować reakcję na dużą skalę (500 μl, wystarczającą do przesiewania 20 płytek 96-dołkowych) przy użyciu tabeli 1.
4. Badania przesiewowe DRaCALA docelowych białek (p)ppGpp
- Rozmrozić i przenieść 20 μl lizatów całych komórek na 96-dołkową płytkę do mikromiareczkowania z dnem w kształcie litery V. Dodać 2,5 j./studzienkę endonukleazy z Serratia marcescens i inkubować w temperaturze 37 °C przez 15 minut w celu zmniejszenia lepkości lizatu. Umieść lizaty na lodzie na 20 minut.
- Wymieszać 32P-pppGpp i 32P-ppGpp w stosunku 1:1 i dodać 1x bufor do lizy L1, aby końcowe stężenie (p)ppGpp było równe 4 nM.
nuta: Biorąc pod uwagę podobieństwo chemiczne między pppGpp i ppGpp, połączenie obu substancji chemicznych uprości proces badań przesiewowych.
- Za pomocą pipety wielokanałowej i końcówek do pipet z filtrem dodaj i wymieszaj 10 μl mieszaniny (p)ppGpp z lizatem komórkowym. Inkubować w temperaturze pokojowej (RT) przez 5 minut.
- Umyj narzędzie do szpilek 96 x, umieszczając je w 0,01% roztworze niejonowego detergentu na 30 s i susz na bibułce przez 30 s. Powtórz mycie narzędzia do szpilek 3x.
- Umieść szpilkę w powyższych 96-dołkowych płytkach na próbki i odczekaj 30 s. Podnieś szpilkę prosto do góry i umieść ją prosto w dół na membranie nitrocelulozowej przez 30 s.
nuta: W przypadku braku plamki należy pobrać 2 μl odpowiednich próbek za pomocą pipety i końcówek z filtrem. Wskazane jest wykonanie zduplikowanego miejsca z tej samej próbki, jak wskazano poniżej.
- Suszyć membranę przez 5 minut w temperaturze pokojowej. Umieść membranę między przezroczystym plastikowym folderem i wystawiaj ją na ekran luminoforowy do przechowywania przez 5 minut. Wizualizacja za pomocą luminowizatora.
5. Kwantyfikacja i identyfikacja potencjalnych białek docelowych
- Użyj oprogramowania analitycznego powiązanego z phosphorimager, aby otworzyć plik .gel z wizualizowanymi płytkami. Użyj funkcji Analiza tablicowa, aby zdefiniować 96 miejsc, konfigurując siatkę 12 kolumn x 8 wierszy.
- Nakreśl duże okręgi, aby oznaczyć zewnętrzną krawędź całych plam (patrz rysunek 1). Wyeksportuj objętość + tło i obszar zdefiniowanych dużych okręgów i zapisz w arkuszu kalkulacyjnym.
nuta: W razie potrzeby zmień położenie każdego pojedynczego okręgu, aby idealnie pokrywał się z punktami, i zmień rozmiar każdego pojedynczego okręgu, aby był nieco większy niż rzeczywisty punkt.
- Zmniejsz rozmiar zdefiniowanych okręgów, aby opisać małe wewnętrzne kropki. Wyeksportuj objętość + tło i obszar zdefiniowanych małych okręgów i zapisz w arkuszu kalkulacyjnym.
- Oblicz ułamki wiążące w arkuszu kalkulacyjnym, korzystając z równania na rysunku 1, a następnie wykreśl dane. Zidentyfikuj potencjalne białka wiążące w studzienkach, które wykazują wysokie frakcje wiążące w porównaniu z większością innych studzienek.
Tabela 1: Gromadzenie informacji dla reakcji syntezy na małą i dużą skalę 32pppGpp znakowanych P. *10x Bufor Relseq zawiera 250 mM Tris-HCl, pH 8,6; 1M NaCl; 80 mM MgCl2. Skrót: pppGpp = pentafosforan guanozyny.
Rozdział
pkt.
szt.
| Objętość (μL) |
| Mała skala | Duża skala |
| Woda ultraczysta | | |
| 10x bufor Relseq* | cyfra arabska | 50 |
| ATP (finał 8 mM) | | |
| Relseq (4 μM finał) | | |
| 32Trifosforan P-α-guanozyny (GTP) (końcowe 120 nM) (UWAGA) | 0,2 | 5 |
| łączny | 20 | 500 |
