Różnicowe promieniste działanie kapilarne testu ligandowego: wysokoprzepustowa technika identyfikacji wewnątrzkomórkowych białek wiążących drugi przekaźnik nukleotydu bakteryjnego

1. Przygotowanie lizatów całokomórkowych

1. Zaszczepić szczepy kolekcjonerskie E. coli K-12 ASKA ORFeome w 1,5 ml bulionu lizogenicznego (LB) zawierającego 25 μg/ml chloramfenikolu w 96-dołkowych płytkach głębokich. Rosnąć przez noc (O/N) przez 18 godzin w temperaturze 30 °C z wytrząsaniem przy 160 obr./min. Następnego dnia dodać izopropylowy β-d-1-tiogalaktopiranozyd (IPTG) (końcowe 0,5 mM) do kultur O/N w celu wywołania ekspresji białka w temperaturze 30 °C przez 6 godzin.
2. Granulki rozdrabniać do 500 x g przez 10 min. Zamrażać granulki w temperaturze -80 °C do momentu użycia. Aby lizować komórki, dodaj 150 μl buforu do lizy L1 (40 mM Tris pH 7,5, 100 mM NaCl, 10 mM MgCl₂, uzupełnione 2 mM fluorkiem fenylometylosulfonylu (PMSF), 40 μg/ml DNazy 1 i 0,5 mg / ml lizozymu) w celu ponownego zawieszenia osadu.
3. Zamrażać komórki w temperaturze -80 °C przez 30 minut, a następnie rozmrażać w temperaturze 37 °C przez 20 minut. Powtórzyć ten cykl trzy razy, aby dokonać lizy komórek. Przed użyciem lizaty przechowywać w temperaturze -80 °C.

2. Oczyszczanie Rel_seq i GppA

UWAGA: Rekombinowane białka Rel_seq ze Streptococcus equisimilis i GppA z E. coli K-12 są używane do syntezy znakowanych radioaktywnie pppGpp i ppGpp, odpowiednio.

1. Hoduj i zbieraj komórki z nadekspresją każdego białka.
   1. Hodować szczep E. coli BL21 DE3 do fazy wykładniczej (gęstość optyczna (OD) ~0,3-0,4) w bulionie LB i odwirować 1 ml kultury przy 6000 x g przez 5 minut. Zdekantować supernatant i ponownie zawiesić komórki 100 μl lodowatego bulionu TSB (bulion LB uzupełniony 0,1 g / ml PEG3350, 0,05 ml / ml dimetylosulfotlenku, 20 mM MgCl₂).
   2. Zmieszać plazmidy zawierające znakowane histydyną relseq i gppA, każdy o wielkości 100 ng, z powyższymi zawiesinami komórek w TSB i inkubować na lodzie przez 30 minut. Szok termiczny komórek w temperaturze 42 °C przez 40 s. Umieścić mieszaninę na lodzie na 2 minuty i dodać 1 ml bulionu LB w temperaturze pokojowej, aby umożliwić komórkom regenerację przez 1 godzinę w temperaturze 37 °C z mieszaniem przy 160 obr./min.
   3. Zebrane komórki ułożyć na płytkach agarowych LB uzupełnionych odpowiednimi antybiotykami (Rel_seq: 100 μg/ml ampicyliny; GppA: 30 μg/ml kanamycyny). Następnego dnia zaszczepić kolonie w bulionie LB, aby rozpocząć prekultury O/N obu szczepów w temperaturze 37 °C.
   4. Po 18 godzinach zaszczepić 500 ml pożywki LB 10 ml kultur O/N i odpowiednimi antybiotykami. Hodować kultury przez wytrząsanie z prędkością 160 obr./min w temperaturze 37 °C. Gdy OD_600nm osiągnie 0,5-0,7, indukuj ekspresję białka, dodając 0,5 mM IPTG i rosnąc przez 3 godziny w temperaturze 30 °C z wytrząsaniem przy 160 obr./min.
   5. Zebrać komórki, wirując w temperaturze 6084 x g przez 10 minut w temperaturze 4 °C. Zawiesić osad w 20 ml lodowatego roztworu soli fizjologicznej buforowanej fosforanem (PBS) i ponownie odwirować przy 1912 x g przez 20 minut w temperaturze 4 °C. Przed użyciem zdekantować supernatant i zamrozić granulki w temperaturze -20 °C.
2. Oczyszczanie powinowactwa do kwasu niklowo-nitrylotrioctowego (Ni-NTA)
   nuta: Od tego momentu należy upewnić się, że próbki są zimne.
   1. Dodać 40 ml lodowatego buforu do lizy L2 (50 mM Tris pH 7,5, 150 mM NaCl, 5% glicerolu, 10 mM imidazolu, 10 mM β-merkaptoetanolu uzupełnionego inhibitorami proteazy (tabletka wolna od EDTA; patrz tabela materiałów) w celu ponownego zawieszenia osadu. Lizuj komórki za pomocą sonikacji (60% amplitudy, 2 s WŁ./ 4 s WYŁĄCZ przez 8 min WŁ.). Oczyścić lizat przez wirowanie w temperaturze 23,426 x g przez 40 minut w temperaturze 4 °C i kontynuować z supernatantem w celu oczyszczenia.
   2. Podczas powyższego wirowania przygotuj żywicę Ni-NTA.
      1. Przenieść 500 μl homogenizowanej żywicy Ni-NTA do stojącej kolumny do chromatografii polipropylenowej i pozostawić na 15 minut, a roztwór do przechowywania spłynie. Przemyć żywicę dwukrotnie 15 ml ultraczystej wody, a następnie przemyć kolumnę 15 ml buforu do lizy L2.
   3. Załadować oczyszczony supernatant lizatu komórkowego z kroku 1 do kolumny i pozwolić mu przepłynąć. Przepłukać kolumnę 30 ml buforu płuczącego (50 mM Tris pH 7,5, 150 mM NaCl, 5% glicerolu, 20 mM imidazolu).
   4. Trzykrotnie eluować białka za pomocą 400 μl buforu elucyjnego (50 mM Tris pH 7,5, 150 mM NaCl, 5% glicerolu, 500 mM imidazolu). Następnie powtórzyć elucję z kolejnymi 300 μl buforu elucyjnego. Połączyć eluowane białka do końcowej objętości 700 μl.
3. Filtracja żelowa
   1. Przygotować żelowy bufor filtracyjny (50 mM Tris, pH 7,5; 200 mM NaCl; 5% glicerolu). Przemyć kolumnę wykluczającą wielkość jedną objętością kolumny (25 ml) żelowego buforu filtracyjnego.
   2. Załadować powyższą próbkę o objętości 700 μl za pomocą pętli o pojemności 500 μl, uruchomić z prędkością 0,5 ml/min i zebrać 2-3 frakcje, każda o objętości 0,5 ml, zawierające odpowiednie białka.
   3. Połączyć i zagęścić frakcje zawierające każde z białek za pomocą kolumny wirowej i zmierzyć stężenie białka za pomocą testu Bradforda.

3. Synteza ³²pppGpp i ppGpp znakowanych P

1. Przeprowadzić reakcję Rel_seq na małą skalę w probówce z nakrętką (patrz Tabela 1).
   nuta: Pracuj z odczynnikami promieniotwórczymi tylko w licencjonowanym miejscu i przy użyciu środków ochrony osobistej.
2. Inkubować probówkę w temperaturze 37 °C w termomikserze przez 1 godzinę, następnie w temperaturze 95 °C przez 5 minut i umieszczać na lodzie przez 5 minut. Odwirować wytrącone białko w temperaturze 15 700 x g przez 5 minut i przenieść supernatant (zsyntetyzowany ³²P-pppGpp) do nowej probówki z nakrętką.
3. Aby zsyntetyzować ³²P-ppGpp z ³²P-pppGpp, przenieś połowę produktu ³²P-pppGpp do nowej probówki z nakrętką i dodaj 1 μM GppA. Inkubować probówkę w temperaturze 37 °C przez 10 minut, w temperaturze 95 °C przez 5 minut, a następnie umieścić na lodzie na 5 minut.
4. Odwirować wytrącone białko w ilości 15 700 x g przez 5 minut i przenieść supernatant (zsyntetyzowany ³²P-ppGpp) do nowej probówki z nakrętką.
5. Analizować ³²P-pppGpp i ³²P-ppGpp, umieszczając 1 μl próbek na płytce do chromatografii cienkowarstwowej (TLC) (płytki TLC z celulozy modyfikowanej polietylenopinaminą) przy użyciu 1,5 M KH₂PO₄, pH 3,4, jako fazy ruchomej.
   nuta: Użyj 5'-trifosforanu guanozyny znakowanego ^α-32P (³²P-α-GTP) jako kontroli.
6. Całkowicie wysusz płytkę TLC, umieść ją między przezroczystym plastikowym folderem i wystaw na ekran luminoforowy do przechowywania przez 5 minut. Wizualizacja i kwantyfikacja sygnałów za pomocą phosphorimager.
   nuta: Gdy proporcje ³²P-pppGpp i ³²P-ppGpp są wyższe niż 85%, można zebrać i zsyntetyzować reakcję na dużą skalę (500 μl, wystarczającą do przesiewania 20 płytek 96-dołkowych) przy użyciu tabeli 1.

4. Badania przesiewowe DRaCALA docelowych białek (p)ppGpp

1. Rozmrozić i przenieść 20 μl lizatów całych komórek na 96-dołkową płytkę do mikromiareczkowania z dnem w kształcie litery V. Dodać 2,5 j./studzienkę endonukleazy z Serratia marcescens i inkubować w temperaturze 37 °C przez 15 minut w celu zmniejszenia lepkości lizatu. Umieść lizaty na lodzie na 20 minut.
2. Wymieszać ³²P-pppGpp i ³²P-ppGpp w stosunku 1:1 i dodać 1x bufor do lizy L1, aby końcowe stężenie (p)ppGpp było równe 4 nM.
   nuta: Biorąc pod uwagę podobieństwo chemiczne między pppGpp i ppGpp, połączenie obu substancji chemicznych uprości proces badań przesiewowych.
3. Za pomocą pipety wielokanałowej i końcówek do pipet z filtrem dodaj i wymieszaj 10 μl mieszaniny (p)ppGpp z lizatem komórkowym. Inkubować w temperaturze pokojowej (RT) przez 5 minut.
4. Umyj narzędzie do szpilek 96 x, umieszczając je w 0,01% roztworze niejonowego detergentu na 30 s i susz na bibułce przez 30 s. Powtórz mycie narzędzia do szpilek 3x.
5. Umieść szpilkę w powyższych 96-dołkowych płytkach na próbki i odczekaj 30 s. Podnieś szpilkę prosto do góry i umieść ją prosto w dół na membranie nitrocelulozowej przez 30 s.
   nuta: W przypadku braku plamki należy pobrać 2 μl odpowiednich próbek za pomocą pipety i końcówek z filtrem. Wskazane jest wykonanie zduplikowanego miejsca z tej samej próbki, jak wskazano poniżej.
6. Suszyć membranę przez 5 minut w temperaturze pokojowej. Umieść membranę między przezroczystym plastikowym folderem i wystawiaj ją na ekran luminoforowy do przechowywania przez 5 minut. Wizualizacja za pomocą luminowizatora.

5. Kwantyfikacja i identyfikacja potencjalnych białek docelowych

1. Użyj oprogramowania analitycznego powiązanego z phosphorimager, aby otworzyć plik .gel z wizualizowanymi płytkami. Użyj funkcji Analiza tablicowa, aby zdefiniować 96 miejsc, konfigurując siatkę 12 kolumn x 8 wierszy.
2. Nakreśl duże okręgi, aby oznaczyć zewnętrzną krawędź całych plam (patrz rysunek 1). Wyeksportuj objętość + tło i obszar zdefiniowanych dużych okręgów i zapisz w arkuszu kalkulacyjnym.
   nuta: W razie potrzeby zmień położenie każdego pojedynczego okręgu, aby idealnie pokrywał się z punktami, i zmień rozmiar każdego pojedynczego okręgu, aby był nieco większy niż rzeczywisty punkt.
3. Zmniejsz rozmiar zdefiniowanych okręgów, aby opisać małe wewnętrzne kropki. Wyeksportuj objętość + tło i obszar zdefiniowanych małych okręgów i zapisz w arkuszu kalkulacyjnym.
4. Oblicz ułamki wiążące w arkuszu kalkulacyjnym, korzystając z równania na rysunku 1, a następnie wykreśl dane. Zidentyfikuj potencjalne białka wiążące w studzienkach, które wykazują wysokie frakcje wiążące w porównaniu z większością innych studzienek.

Tabela 1: Gromadzenie informacji dla reakcji syntezy na małą i dużą skalę ³²pppGpp znakowanych P. *10x Bufor Relseq zawiera 250 mM Tris-HCl, pH 8,6; 1M NaCl; 80 mM MgCl₂. Skrót: pppGpp = pentafosforan guanozyny.

Rysunek 1: Kwantyfikacja i obliczanie frakcji wiążącej. Szczegółowe informacje można znaleźć w tekście. Krótko mówiąc, plamki DRaCALA zostaną przeanalizowane poprzez narysowanie dwóch okręgów, które opisują całą plamkę i wewnętrzną ciemną kropkę (tj. zatrzymaną (p)ppGpp ze względu na wiązanie badanego białka). Specyficznym sygnałem wiążącym jest sygnał promieniotwórczy wewnętrznego okręgu (S1) po odjęciu niespecyficznego sygnału tła (obliczony według wzoru A1 × ((S2-S 1)/(A2-A 1))). Frakcja wiążąca to specyficzny sygnał wiążący podzielony przez całkowity sygnał promieniotwórczy (S2). Skróty: DRaCALA = Różnicowe promieniste działanie kapilarne testu ligandowego; p)ppGpp = penta- i tetrafosforany guanozyny; RT = temperatura pokojowa.