Test obrazowania za pomocą sondy fluorescencyjnej: technika wizualizacji stresu oksydacyjnego w reaktywnych formach tlenu Hodowane komórki organoidów jelitowych poddane działaniu induktora

Streszczenie

Źródło: Stedman, A. et al., Analiza stresu oksydacyjnego w organoidach jelitowych myszy przy użyciu reaktywnej sondy fluorogenicznej wrażliwej na gatunki tlenu. J. Vis. Exp. (2021).

Ten film opisuje technikę wizualizacji stresu oksydacyjnego w hodowanych organoidach. Praca ta pomaga w zrozumieniu poziomu stresu oksydacyjnego spowodowanego akumulacją ROS w różnych typach komórek obecnych w organoidzie po leczeniu różnymi modulatorami ROS.

Protokół

1. Wizualizacja stresu oksydacyjnego w organoidach 3D za pomocą mikroskopii konfokalnej

1. Pobrać organoidy posiane w 8 studzienkach μ-Slide i dodać 1 μl N-acetylocysteiny lub roztworu podstawowego NAC do odpowiednich studzienek, aby uzyskać końcowe stężenie 1 mM.
2. Inkubować przez 1 godzinę w temperaturze 37 °C i 5% CO₂ .
3. Dodać 1 μl roztworu podstawowego tBHP do odpowiednich studzienek, aby uzyskać końcowe stężenie 200 μM.
4. Inkubować przez 30 minut w temperaturze 37 °C i 5% CO₂ .
5. Dodać 1 μl na studzienkę z rozcieńczenia 1,25 mM sondy fluorogenicznej, aby uzyskać końcowe stężenie 5 μM.
6. Dodać 1 μl do studzienki rozcieńczonego 1,25 mg/ml Hoechst, aby uzyskać końcowe stężenie 5 μg/ml.
7. Inkubować przez 30 minut w temperaturze 37 °C i 5% CO₂ .
8. Usuń podłoże, nie naruszając BMM. Delikatnie dodaj 250 μl ciepłego DMEM bez czerwieni fenolowej.
   nuta: Jeśli planowane jest długoterminowe przejęcie, dodaj związki czynników wzrostu do DMEM bez czerwieni fenolowej.
9. Zobrazuj organoidy za pomocą mikroskopu konfokalnego wyposażonego w komorę termiczną i dopływ gazu, który wykrywa sondę fluorogeniczną (ROS).
   nuta: Wzbudzenie/emisja (ex/em) dla sondy fluorogenicznej wynosi 644/665, ex/em dla Hoechst (jądra) wynosi 361/486, a ex/em dla GFP (jelitowa komórka macierzysta od myszy Lgr5-GFP) wynosi 488/510. Obiektyw z 63-krotnym zanurzeniem w oleju służy do wykrywania sygnałów w komórkach macierzystych. Nie zmieniaj ustawień lasera między próbkami. Obiektyw 20x może być użyty, aby umożliwić przegląd produkcji ROS.
10. Użyj kontroli dodatniej, aby ustawić intensywność lasera i czas ekspozycji na sygnał ROS i sprawdź, czy ten sygnał jest niższy w kontroli ujemnej.
11. Za pomocą okularu przesuń szkiełko, aby zidentyfikować organoidy GFP wyrażające i dostosować intensywność lasera.
    nuta: Ten krok jest wykonywany ręcznie.
12. Zdefiniuj pozycje, aby uzyskać zszyty obraz całego organoidu. Ustaw stos z 25 μm (rozmiar kroku 5 μm), aby uzyskać sekcję organoidów pokazującą jedną warstwę komórek.
    nuta: Zapoznaj się z instrukcją obsługi mikroskopu, aby zoptymalizować konfigurację. Korzystając z żywych komórek, akwizycję należy przeprowadzić w ciągu 1 godziny po zakończeniu inkubacji.
13. Otwórz obrazy w oprogramowaniu do przetwarzania obrazów o otwartym kodzie źródłowym (patrz Spis materiałów).
14. Przejdź przez z-stack i wybierz sekcję, w której środek organoidów jest dobrze reprezentowany i utwórz nowy obraz z wybranym obszarem.
15. Określ ilościowo obrazy zgodnie z poniższymi krokami.
    1. Wybierz narzędzie Linia odręczna.
    2. Narysuj linię wzdłuż jąder.
       nuta: Należy wybrać tylko regiony z komórkami GFP-dodatnimi, jeśli analizowane są tylko komórki macierzyste.
    3. Zwiększ szerokość linii, aby pokryć warstwę komórki linią bez uwzględniania resztek świetlnych.
    4. Wybierz kanał dla sygnału ROS i zmierz intensywność fluorescencji w wybranym regionie i dodaj adnotacje do wartości.
    5. Narysuj linię w miejscu, w którym nie ma sygnału i zmierz natężenie fluorescencji tła, które zostanie odjęte od poprzedniej wartości, aby uzyskać ostateczną intensywność.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
Myszy
Lgr5-EGFP-IRES-creERT2 (Lgr5- GFP)	Laboratorium Jacksona
Pożywka do kultur wzrostu
Zaawansowany DMEM F12 (DMEM/F12)	Rybak termiczny	12634010
Penicylina-Streptomycyna (P/S)	Rybak termiczny	15140122	Stężenie podstawowe: 100x (10 000 jednostek/ml penicyliny i 10 000 μg/ml streptomycyny)
FLuoroBrite DMEM (DMEM bez czerwieni fenolowej)	Rybak termiczny	A1896701
Hoechst 33342	Rybak termiczny	Zobacz materiał H3570	zapas w stężeniu 10 mg/ml
Zredukowany czynnik wzrostu Matrigel, bez czerwieni fenolowej (matryca błony podstawnej)	Corning	356231	Po otrzymaniu rozmrozić O/N w lodówce, przechowywać przez 1 godzinę na lodzie i przygotować 500 ml porcji i przechowywać w temperaturze -20 °C
μ-Slide 8 Studzienki	Ibidi	Numer katalogowy: 80826
N-acetylocysteina (NAC)	Sigma	A9165
Roztwór wodoronadtlenku tert-butylu (tBCHP) (70% wag. W H2O2)	Sigma	458139
Programy i sprzęt
Fidżi/ImageJ			https://imagej.net/software/fiji/ pobieranie obrazów
Obserwator.Z1	Zeiss		układ konfokalny
Opterra (konfokal zamiatany polem)	Bruker		układ konfokalny
szybka kamera EMCCD Evolve Delta 512	Fotometria		układ konfokalny
pryzmat	Oprogramowanie GraphPad		analiza statystyczna