Wszystkie procedury dotyczące modeli zwierzęcych zostały sprawdzone przez lokalny instytucjonalny komitet opieki nad zwierzętami oraz weterynaryjną komisję rewizyjną JoVE.
1. Przygotowanie odczynników i materiałów do hodowli organoidów jelitowych
- Aby przygotować pożywkę do hodowli wzrostu, wymieszaj zaawansowany DMEM/F-12 uzupełniony 1x glutaminą, 1x roztworem penicyliny/streptomycyny (P/S), 10 mM HEPES, 50 ng/ml mysiego EGF, 20 μg/ml mysiego Noggin, 500 ng/ml mysiego R-Spondin1 (patrz Tabela materiałów). Pozostaw pożywkę w temperaturze pokojowej (RT) podczas ekstrakcji krypty.
nuta: Niewykorzystane podłoże zamrozić w porcjach w temperaturze -20 °C. Unikać zamrażania i rozmrażania.
- Napełnij probówkę o pojemności 50 ml 40 ml Advanced DMEM/F-12 i trzymaj ją na lodzie.
nuta: Niewykorzystane podłoże należy przechowywać w temperaturze 4 °C. Będzie używany do pasażowania organoidów.
- Płytki do hodowli komórkowych (96-dołkowe okrągłe dno) należy wstępnie ogrzać w inkubatorze w temperaturze 37 °C.
- Rozmrozić podwielokrotności matrycy membrany podstawnej (BMM) (patrz tabela materiałów) na lodzie (przed rozpoczęciem protokołu lub co najmniej 1 godzinę przed poszyciem krypt).
nuta: BMM szybko zestala się, jeśli nie jest przechowywany w niskiej temperaturze.
- Przygotować roztwór do mycia/płukania, dodając 1% roztwór penicyliny i streptomycyny do DPBS (DPBS-P/S).
- Napełnij szalkę Petriego o średnicy 100 mm 10 ml zimnego DPBS-P/S. Napełnij sześć probówek o pojemności 15 ml 10 ml DPBS i oznacz je od F1 do F6.
- Przygotować 30 ml 10 mM roztworu EDTA przez rozcieńczenie z 0,5 M EDTA w DPBS. Napełnij dwie probówki o pojemności 15 ml 10 ml 10 ml EDTA i oznacz je jako E1 i E2.
- Wszystkie roztwory należy wstępnie schłodzić w temperaturze 4°C i przechowywać je na lodzie podczas zabiegu.
2. Hodowla organoidów jelitowych
- Poświęć 8-10 tygodniową mysz Lgr5-EGFP-IRES-creERT2 (Lgr5-GFP) zgodnie z krajowymi przepisami i regulacjami.
- Zbierz 5-8 cm jelita czczego obejmującego obszar między dwunastnicą (5 cm od żołądka) a jelitem krętym (10 cm od jelita ślepego) i trzymaj w chłodnym DPBS-P/S na lodzie.
- Oczyść treść jelitową, przepłukując ją 5-10 ml zimnego DPBS-P/S.
nuta: Domowe strzykawki do płukania można uzyskać, podłączając końcówkę o pojemności 200 μl do dyszy strzykawki o pojemności 10 ml.
- Otworzyć jelito wzdłużnie za pomocą nożyczek z końcówką kulową (patrz tabela materiałów) (aby zapobiec uszkodzeniu tkanki).
- Za pomocą kleszczy przenieś tkankę na szalkę Petriego zawierającą zimny DPBS-P/S w temperaturze pokojowej i wstrząśnij nią w celu spłukania.
- Za pomocą plastikowej pipety Pasteura chwyć jelito przez aspirację i przenieś je do 15 ml probówki oznaczonej E1 zawierającej 10 ml zimnego 10 mM EDTA.
- Odwróć probówkę 3 razy i inkubuj na lodzie przez 10 minut.
- Za pomocą plastikowej pipety Pasteura przenieś tkankę do probówki F1 zawierającej 10 ml DPBS. Wiruj przez 2 minuty (w normalnym wirze, trzymając rurkę w ręku i upewniając się, że jelito ładnie wiruje).
- Umieść 10 μl frakcji na szalce Petriego i oceń jakość frakcji pod mikroskopem.
nuta: Wszystkie etapy wirowania są wykonywane z maksymalną prędkością, a jakość każdej frakcji powinna być oceniana pod mikroskopem (rysunek 1).
- Za pomocą plastikowej pipety Pasteura chwycić jelito przez aspirację i przenieść je do probówki F2 zawierającej 10 ml DPBS i wirować przez 2 minuty.
- Powtórzyć krok 2.10, przenosząc tkankę do probówki F3 zawierającej 10 ml DPBS i wirować przez 2 minuty.
- Powtórzyć inkubację EDTA, jak w kroku 2.6, przenosząc tkankę do probówki E2 zawierającej 10 mM EDTA.
- Odwróć probówkę 3 razy i inkubuj na lodzie przez 5 minut.
- Powtórzyć krok 2.10, przenosząc tkankę do probówki F4 zawierającej 10 ml DPBS i wirować przez 3 minuty.
- Powtórzyć krok 2.14, przenosząc tkankę do probówki F5 zawierającej 10 ml DPBS i wirować przez 3 minuty.
- Powtórzyć krok 2.15, przenosząc tkankę do probówki F6 zawierającej 10 ml DPBS i wirować przez 3 minuty.
- Połącz najlepsze frakcje filtrowane grawitacyjnie przez sitko o pojemności 70 μm z probówką o pojemności 50 ml (na lodzie), aby wyeliminować kosmki i znaczne zanieczyszczenia.
nuta: Zazwyczaj F5 i F6 to frakcje zawierające liczne krypty i mniej gruzu.
- Wirować krypty w temperaturze 150 x g w temperaturze 4 °C przez 3 minuty.
- Opróżnij probówkę, rozbij osad mechanicznie i dodaj 5 ml zimnego DMEM/F12.
- Umieścić 10 μl zawiesiny na szalce Petriego i ręcznie pod mikroskopem policzyć liczbę krypt obecnych w podwielokrotności.
nuta: Nie licz pojedynczych komórek ani małych zanieczyszczeń.
- Oblicz wymaganą objętość (V) zawiesiny krypt w μl, biorąc pod uwagę, że 300 krypt jest platerowanych na jeden odwiert, W to liczba dołków, a N to liczba krypt liczonych z 10 μl zawiesiny. Przenieś krypty do nowej probówki o pojemności 15 ml.
nuta: V = 300 x W x 10/N. Jeśli w planowanym eksperymencie zostanie użyta mała objętość, można użyć probówki wirówkowej o pojemności 1,5 ml.
- Wirować krypty w temperaturze 200 x g w temperaturze 4 °C przez 3 minuty.
- Ostrożnie usunąć supernatant za pomocą pipety.
- Mechanicznie rozdrobnić osad i delikatnie dodać pożywkę do hodowli wzrostu, aby uzyskać stężenie 90 krypt/μl.
- Dodać 2 objętości nierozcieńczonego BMM, aby uzyskać końcowe stężenie 30 krypt/μl. Ostrożnie pipetować w górę i w dół, nie wprowadzając pęcherzyków powietrza do mieszanki.
nuta: Zawsze trzymaj rurkę na lodzie, aby uniknąć zestalenia BMM.
- Płytka 10 μl krypt/BMM wymieszać z każdą studzienką. Do analizy cytometrii przepływowej należy używać okrągłodennych 96-dołkowych płytek. Rozprowadź 10 μl na środku każdej studzienki jako kopułę.
nuta: Pokryj organoidy cienką warstwą do testu obrazowania, aby umożliwić ich dogłębne obrazowanie.
- Pozostaw płytkę na 5 minut w temperaturze pokojowej, aby BMM zestalił się. Umieścić płytkę w inkubatorze w temperaturze 37 °C i 5% CO2 na 15 minut.
- Dodaj 250 μl pożywki wzrostowej do każdej studzienki, uważając, aby nie odłączyć BMM.
- Umieścić płytki w inkubatorze w temperaturze 37 °C i 5% CO2 .
- Wykonaj analizę ROS między 4 a 6 dniem hodowli. W przeciwnym razie zmień pożywkę i podziel organoidy po pojawieniu się kilku długich pączkujących struktur i gdy martwe komórki zgromadzą się w światłach organoidów.
3. Organoidy pasażujące
- Organoidy jelita cienkiego należy rozpocząć od 6dnia hodowli, kiedy uformują się znaczące struktury pączkujące, a światło organoidów stanie się ciemne.
nuta: Światło organoidu staje się ciemne z powodu nagromadzenia martwych komórek, gruzu i śluzu. Nie pozwól, aby organoidy przerosły przed podziałem. Współczynnik podziału zależy od wzrostu organoidów. Zaleca się pasażowanie organoidów w stosunku 1:2 w 6. dniu i 1:3 w 10. dniu.
- Napełnij probówkę o pojemności 15 ml 4 ml zimnego Advanced DMEM/F-12 i trzymaj ją na lodzie.
nuta: Tutaj podane są objętości dla 96-dołkowej płytki hodowlanej. Jeśli używany jest inny format, dostosuj odpowiednio głośność.
- Ostrożnie odessać pożywkę za pomocą pipety lub pompy próżniowej ze studzienek, nie dotykając kopuł BMM, i wyrzucić ją.
- Dodać 100 μl zimnego Advanced DMEM/F-12 do dołka. Pipetować w górę i w dół, aby rozbić BMM i przenieść zawartość studzienki do probówki o pojemności 15 ml.
- Umyj studzienkę 200 μl zimnego Advanced DMEM/F-12 i zbierz ją do tej samej probówki.
nuta: W przypadku przechodzenia przez wiele studzienek z tych samych warunków eksperymentalnych, zawartość studzienek można zebrać w tej samej probówce zbiorczej o pojemności 15 ml.
- Wirować probówkę zbiorczą o pojemności 15 ml przy 100 x g przez 5 minut w temperaturze 4°C.
- Odrzucić supernatant i dodać 1 ml zimnego Advanced DMEM/F-12 do osadu. Używając końcówki P1000, weź końcówkę P10 (bez filtra) i pipetuj w górę i w dół co najmniej 20 razy.
- Dodać 4 ml zimnego Advanced DMEM/F-12 do probówki. Wirować z prędkością 300 x g przez 5 minut w temperaturze 4°C.
- Odessać supernatant za pomocą pipety lub pompy próżniowej, nie naruszając osadu. Następnie rozerwij granulkę mechanicznie.
- Dodać BMM rozcieńczony w pożywce do hodowli wzrostu (stosunek 2:1). Ostrożnie pipetować w górę i w dół, nie wprowadzając pęcherzyków powietrza do mieszanki.
- Płytka 10 μl krypt/BMM wymieszać z każdą studzienką.
- Trzymaj płytkę przez 5 minut w temperaturze pokojowej, aby BMM zastygł. Umieścić płytkę w inkubatorze w temperaturze 37 °C i 5% CO2 na 15 minut.
- Dodać 250 μl pożywki wzrostowej do każdej studzienki.
nuta: Uważaj, aby nie odczepić BMM.
- Umieścić płytki w inkubatorze w temperaturze 37 °C i 5% CO2 .
4. Przygotowanie odczynników i materiałów do oceny stresu oksydacyjnego w organoidach jelitowych
- Przygotować 250 mM roztwór podstawowy inhibitora N-acetylocysteiny (NAC) (patrz tabela materiałów) i ponownie zawiesić 10 mg z 245 μl DPBS. Stosować w stężeniu końcowym 1 mM.
- Przygotować 50 mM roztwór podstawowy induktora wodoronadtlenku tert-butylu (tBHP), 70% w wodzie i rozcieńczyć 3,22 μl 496,8 μl DPBS. Stosować w stężeniu końcowym 200 μM.
- Do badania cytometrii przepływowej należy przygotować roztwór roboczy o stężeniu 250 μM z sondy fluorogenicznej (patrz tabela materiałów), rozcieńczając roztwór podstawowy w stosunku 1:10 w DMSO. Stosować przy stężeniu końcowym 1 μM.
nuta: Jak wskazano w instrukcjach producenta, sonda fluorogeniczna jest wrażliwa na światło i tlen. Akcje i podwielokrotności nie powinny być otwierane i zamykane zbyt wiele razy.
- Przygotować końcowy roztwór 0,1 μg/ml DAPI w DPBS, który ma być użyty do dyskryminacji martwych komórek w teście cytometrii przepływowej.
nuta: Etapy te opisują stosowanie kontroli ujemnych i dodatnich, które muszą być włączone do wszelkich testów, przy użyciu warunków wskazanych na rysunku 2A. Test może być stosowany do badania związków przeciw- lub prooksydacyjnych. Kroki są takie same, a jedyna różnica polega na tym, że związki są dodawane przed użyciem barwnika fluorogenicznego.
5. Kwantyfikacja stresu oksydacyjnego na zdysocjowanych organoidach za pomocą cytometru przepływowego
- Dodać 1 μl roztworu podstawowego NAC do studzienek w celu kontroli ujemnej, aby uzyskać końcowe stężenie 1 mM.
nuta: Użyć organoidów posianych w 96-dołkowych płytkach z okrągłym dnem.
- Inkubować przez 1 godzinę w temperaturze 37 °C i 5% CO2 .
- Dodać 1 μl roztworu podstawowego tBHP do odpowiednich studzienek, aby uzyskać końcowe stężenie 200 μM.
- Inkubować przez 30 minut w temperaturze 37 °C i 5% CO2 .
- Za pomocą pipety wielokanałowej usuń pożywkę, nie naruszając dołączonego BMM i przenieś ją na inną 96-dołkową okrągłą płytkę denną. Odłóż ten talerz na bok.
- Dodaj 100 μl trypsyny i za pomocą pipety wielokanałowej pipetuj w górę i w dół co najmniej pięć razy, aby zniszczyć BMM.
- Inkubować nie dłużej niż 5 minut w temperaturze 37 °C i 5% CO2 .
- Za pomocą pipety wielokanałowej pipetę należy pipetować w górę i w dół co najmniej pięć razy, aby oddzielić organoidy.
- Wirować z prędkością 300 x g przez 5 minut przy RT.
- Odrzucić supernatant przez odwrócenie płytki. Dodać z powrotem pożywkę zebraną w kroku 6.3 do odpowiednich studzienek i ponownie zawiesić komórki, pipetując w górę i w dół 5 razy.
- Dodać sondę fluorogeniczną o końcowym stężeniu 1 μM. Dodać 1 μl do studzienki z rozcieńczenia 250 μM i inkubować przez 30 minut w temperaturze 37 °C i 5% CO2,
nuta: Nie dodawaj sondy fluorogenicznej do studzienek potrzebnych do ustawień przyrządu (Rysunek 2B).
- Wirować z prędkością 300 x g przez 5 minut przy RT.
- Zawiesić komórki w 250 μl 0,1 μg/ml roztworu DAPI. Przenieść próbki do odpowiednich probówek do cytometrii przepływowej, trzymać probówki na lodzie i kontynuować analizę.
nuta: Dodaj PBS zamiast DAPI do studzienek potrzebnych do ustawień instrumentu (rysunek 2B).
- Zoptymalizuj ustawienia napięcia rozproszenia przedniego i bocznego na niebarwionych napięciach kontrolnych i laserowych dla każdego fluoroforu przy użyciu monobarwionych próbek.
- Stosując odpowiednią strategię bramkowania (Rysunek 3A), zbierz co najmniej 20 000 zdarzeń.
UWAGA: Preferowanych jest 50 000 wydarzeń. Szczegółowe ustawienia akwizycji różnią się w zależności od używanego instrumentu.
