Test SUMOylacji: technika in vitro do wykrywania stanu SUMOylacji białek substratowych za pomocą immunoblottingu

Streszczenie

Źródło: Yang, W. S. et al., Test SUMOylacji in vitro do badania aktywności ligazy SUMO E3. J. Vis. Exp. (2018)

Ten film demonstruje metodę in vitro do SUMOylacji białek substratowych przy użyciu sekwencyjnej kaskady enzymatycznej. Ponadto status SUMOylacji białka jest identyfikowany za pomocą techniki elektroforezy i immunoblottingu.

Protokół

1. Przygotowanie konstrukcji ekspresji bakulowirusa

1. Oczyść ligazę SUMO E3 K-bZIP poprzez sklonowanie cDNA K-bZIP do wektora bakulowirusa o podwójnej ekspresji (patrz tabela materiałów) z N-końcowym znacznikiem epitopu. Odnieśliśmy sukces przy użyciu znacznika oktapeptydu (oznaczonego w całym protokole jako vector-tag-K-bZIP).
   nuta: Matrycą DNA do klonowania reakcji łańcuchowej polimerazy (PCR) K-bZIP jest cDNA poddany odwrotnej transkrypcji z RNA wyizolowanego z komórek TREx F3H3-K-Rta BCBL-1 po leczeniu doksycykliną.
   1. Przenieś cDNA K-bZIP o pełnej długości do wektora podwójnej ekspresji z miejscami klonowania CpoI. CpoI trawi produkt PCR i 1 μg wektora podwójnej ekspresji w temperaturze 37 °C przez 3 godziny.
   2. Oddziel i wyekstrahuj strawione DNA po elektroforezie na 0,8% żelu agarozowym. Związać wstawkę (K-bZIP) i wektor za pomocą ligazy DNA T4 w temperaturze 16 °C przez 30 minut zgodnie z instrukcjami producenta (patrz tabela materiałów).
   3. Dodać 5 μl DNA do 50 μl kompetentnych komórek E. coli "A" (patrz tabela materiałów) w probówce o pojemności 1,5 ml. Kładziemy na lodzie na 30 min. Następnie inkubować probówkę o pojemności 1,5 ml w łaźni wodnej o temperaturze 42 °C przez 45 s i natychmiast umieścić probówkę na lodzie na 3 minuty.
   4. Dodać 600 μL S.O.C. (0,5% (w/v) ekstraktu drożdżowego, 2% (w/v) tryptonu, 10 mM NaCl, 2,5 mM KCl, 20 mM_MgSO4 i 4% (w/v) glukozy) do probówki i inkubować w temperaturze 37 °C przez 1 godzinę. Następnie odwirować probówkę w temperaturze pokojowej przez 3 minuty przy 600 x g.
   5. Usunąć supernatant, ponownie zawiesić osad z 60 μl pożywki Luria-Bertani (LB; 1% (w/v) tryptonu, 0,5% (w/v) ekstraktu drożdżowego i 85 mM NaCl) i rozprowadzić na płytkach agarowych LB zawierających 100 μg/ml ampicyliny. Inkubować płytkę agarową w temperaturze 37 °C przez 16 godzin.
   6. Wybierz 1 kolonię do zaszczepienia w pożywce 5 ml LB zawierającej 100 μg/ml ampicyliny i hoduj w temperaturze 37 °C przez 16 godzin z wytrząsaniem 250 obr./min. Następnie wyekstrahuj plazmid, vector-tag-K-bZIP, za pomocą zestawu do ekstrakcji plazmidu zgodnie z instrukcjami producenta (patrz Tabela materiałów).
2. Wygeneruj rekombinowany bakmid zawierający znacznik K-bZIP poprzez przekształcenie znacznika wektora K-bZIP w kompetentne komórki E. coli "B" (patrz Tabela materiałów).
   1. Wymieszaj 0,2 μg plazmidu vector-tag-K-bZIP i 100 μl właściwego E. komórki coli "B" w probówce o pojemności 1,5 ml i umieścić na lodzie na 30 minut. Inkubować probówkę w łaźni wodnej o temperaturze 42 °C przez 45 s i natychmiast umieścić probówkę na lodzie na 3 minuty.
   2. Dodać 900 μl pożywki S.O.C. do probówki i inkubować w temperaturze 37 °C przez 4 godziny, obracając się z prędkością 50 obr./min. Następnie weź 10 μl pożywki i dodaj dodatkowe 50 μl pożywki SOC do rozprowadzenia na płytkach agarowych LB zawierających 50 μg/ml kanamycyny, 7 μg/ml gentamycyny, 10 μg/ml tetracykliny, 100 μg/ml substratu galaktozydazy i 40 μg/ml izopropylu β-D-1-tiogalaktopiranozydu (IPTG), i inkubować płytki przez 48 godzin w temperaturze 37 °C.
   3. Zaszczepić jedną białą kolonię w pożywce o pojemności 5 ml LB zawierającej 50 μg/ml kanamycyny, 7 μg/ml gentamycyny i 10 μg/ml tetracykliny. Inkubować w temperaturze 37 °C z prędkością 250 obr./min, wytrząsając przez 16 godzin.
   4. Wyizolować rekombinowany bakmidowy DNA zawierający znacznik K-bZIP, określić ilościowo i ponownie zawiesić w stężeniu 1 μg/μl.
3. Generowanie rekombinowanych bakulowirusów wykazujących ekspresję tag-K-bZIP poprzez transfekcję 1 μg rekombinowanego bakmidowego DNA zawierającego tag-K-bZIP do komórek Sf9 w jednym dołku płytki 6-dołkowej.
   1. Wysiewaj 2 x 10⁶ komórek Sf9 (patrz tabela materiałów) w 2 ml pożywki dla owadów Grace's Insect Medium zaopatrzonej w 10% płodową surowicę bydlęcą (FBS) i 1% gentamycyny w każdym dołku na 6-dołkowej płytce, a następnie inkubuj w temperaturze 27 °C przez 1 godzinę.
   2. Utrzymuj hodowlę komórek Sf9 w fazie logarytmicznej komórek Sf9 w pożywce dla owadów Grace zaopatrzonej w 10% FBS, 1% gentamycyny i 1% detergentu C (patrz Tabela Materiałów) w temperaturze 27 °C w zawiesinie orbitalnej przy 140 obr./min. Policz komórki za pomocą hemocytometru i barwienia błękitem trypana; Żywotność komórek powinna przekraczać 95%. Utrzymuj komórki, stosując stosunek subhodowli 1:3 co 2-3 dni (minimalna gęstość ~0,5 x 10⁶ komórek/ml).
   3. Dodać 2 μl bakmidowego DNA (1 μg/μl) i 98 μl zredukowanej pożywki surowicy (patrz tabela materiałów) do probówki o pojemności 2 ml. Następnie dodać 4 μl odczynnika do transfekcji (patrz Tabela Materiałów) do probówki i dobrze wymieszać. Inkubować w temperaturze pokojowej przez 15 minut.
   4. Dodać tę mieszaninę transfekcji (104 μl) do każdej studzienki i inkubować w temperaturze 27 °C przez 12-16 godzin.
   5. Usuń wyczerpaną pożywkę za pomocą delikatnego zasysania i zastąp ją 2 ml świeżej pożywki dla owadów Grace's Insect Medium zawierającej 10% FBS i 1% gentamycyny. Komórki Sf9 luźno przylegają do powierzchni płytki i nie zostaną naruszone przy delikatnym zasysaniu.
4. Zebrać rekombinowanego bakulowirusa po transfekcji i amplifikować bakulowirusa w celu uzyskania zapasów o wysokim mianie (P1) do dalszych eksperymentów.
   1. 72 godziny po zmianie pożywki zeskrobać komórki Sf9 za pomocą sterylnego podnośnika komórek, zebrać supernatant z każdej pojedynczej studzienki do probówki o pojemności 1,5 ml i wirować przez 10 s.
   2. Wirować w temperaturze 4 °C przez 3 minuty przy 150 x g. Zebrać supernatant jako bakulowirus P0 i podwielokrotność w probówkach o pojemności 1,5 ml (1 ml bakulowirusa w każdej probówce). Przechowywać w temperaturze -80 °C.
   3. Wysiew 1 x 10⁷ komórek Sf9 w 10 ml pożywki dla owadów Grace's Insect Medium dostarczanej z 10% FBS i 1% gentamycyny na 10 cm szalce Petriego i inkubuj w temperaturze 27 °C przez 1 godzinę.
   4. W celu amplifikacji rekombinowanych bakulowirusów wykazujących ekspresję tag-K-bZIP dodać 0,5 ml bakulowirusa P0 do wysianych komórek Sf9 i inkubować w temperaturze 27 °C przez 48 godzin.
   5. Zebrać supernatant jako bakulowirus P1 w probówce o pojemności 15 ml i przechowywać w temperaturze 4 °C przez okres do 1 miesiąca.

2. Oczyszczanie K-bZIP

1. Utrzymuj hodowlę komórek Sf9 w fazie logarytmicznej komórek Sf9 w pożywce dla owadów Grace's Insect Medium dostarczanej z 10% FBS, 1% gentamycyny i 1% detergentu C w temperaturze 27 °C w zawiesinie orbitalnej przy 140 obr./min, jak opisano w kroku 1.3.2.
2. W dniu transdukcji dodać 1 ml supernatantu (P1) zawierającego bakulowirusa do 250 ml komórek Sf9 o gęstości 2 x 10⁶ komórek/ml.
3. Inkubować komórki Sf9 przez 72 godziny w temperaturze 27 °C na wytrząsarce orbitalnej z wytrząsaniem 140 obr./min, a następnie zbierać przez odwirowanie w temperaturze 2,740 x g przez 15 minut w temperaturze 4 °C.
4. Usunąć supernatant i granulki komórek lizy w 10 ml buforze do lizy (20 mM HEPES pH 7,9, 0,5 M NaCl, 1% detergentu A (patrz tabela materiałów), 2% glicerolu, koktajlu inhibitorów proteazy) i obracać z prędkością 50 obr./min za pomocą mieszadła zawiesinowego w temperaturze 4 °C przez 30 min.
5. Odwirować lizat komórkowy przy 15 000 x g przez 15 minut w celu zebrania supernatantu.
6. Aby oczyścić znacznik K-bZIP, należy inkubować lizaty komórkowe (10 ml) z 50 μl kulek magnetycznych znakowanych przeciwciałami w probówkach polipropylenowych o pojemności 14 ml i obracać z prędkością 50 obr./min przez 3 godziny w temperaturze 4 °C za pomocą mieszadła zawiesinowego. Po wychwyceniu białka granulki należy osadzać w wirowaniu 800 x g przez 30 s w temperaturze 4 °C. Usunąć większość supernatantu, ponownie zawiesić kulki w pozostałej objętości około 1 ml i przenieść do probówki o pojemności 1,5 ml w celu przemycia.
7. Przemyj wychwycone białko, umieszczając probówkę zawierającą kulki na stojaku magnetycznym i usuń supernatant, gdy kulki magnetyczne całkowicie przylgną do boku probówki.
8. Umyj kulki buforem do lizy cztery razy.
   1. Dodaj 1 ml buforu do lizy do probówek o pojemności 1,5 ml i odwróć probówki 10 razy. Umieścić probówkę o pojemności 1,5 ml na stojaku magnetycznym i usunąć supernatant zgodnie z opisem w ppkt 2.7.
   2. Powtórz poprzedni krok jeszcze 3 razy.
9. Umyj kulki jednorazowo solą fizjologiczną buforowaną fosforanami (PBS).
   1. Dodaj 1 ml PBS (137 mM NaCl, 2,7 mM KCl, 8 mM Na₂HPO₄, 1,5 mM KH₂PO₄) do probówek 1,5 ml i odwróć probówki 10 razy.
   2. Umieść probówkę o pojemności 1,5 ml na stojaku magnetycznym, a następnie usuń supernatant.
10. Elute białko tag-K-bZIP z kulek magnetycznych znakowanych przeciwciałami przez dodanie 100 μl oktapeptydu 150 μg/ml rozcieńczonego w PBS do probówki o pojemności 1,5 ml. Obracać rurkę przez 10 minut przy 50 obr./min za pomocą mieszadła zawiesinowego w temperaturze pokojowej. Następnie umieść probówkę z powrotem na stojaku magnetycznym i zbierz supernatant zawierający K-bZIP w czystej probówce o pojemności 1,5 ml.
11. Przeanalizuj 1-5 μl oczyszczonego białka tag-K-bZIP za pomocą SDS-PAGE, a następnie zabarwić Coomassie na niebiesko. Załadować 2 μg, 1 μg i 0,5 μg próbek albuminy surowicy bydlęcej (BSA) na ten sam żel i użyć go do oznaczania ilościowego za pomocą programu do przetwarzania obrazu, takiego jak ImageJ. Oszacuj stężenie K-bZIP przez porównanie z normami BSA.
12. Oczyszczony K-bZIP jest teraz gotowy do użycia w każdym teście SUMOylacji. Rozcieńczyć K-bZIP w PBS do końcowego stężenia 100 ng/μl i przechowywać w małych porcjach w temperaturze -80 °C.

3. Test sumoylacyjny

1. Dodać 3 μl 100 ng/μl oczyszczonego tag-K-bZIP do mieszaniny głównej każdej reakcji sumoylacji in vitro. Składniki mieszanki głównej zawierają 1 μl buforu białkowego, 1x bufor SUMOylacyjny, 0,5 μl białka p53 (0,5 mg/mL), 25 nM enzymu aktywującego E1 (stężenie wyjściowe: 1 μM), 50 nM enzymu sprzężającego E2 (stężenie podstawowe: 10 μM) i 250 nM każdy z peptydów SUMO (SUMO-1, SUMO-2 lub SUMO-3; zawartość magazynowa: 5 μM) do końcowej objętości 17 μl.
2. Delikatnie wymieszać zawartość i inkubować reakcję w temperaturze 30 °C przez 3 godziny. Zatrzymać reakcję przez dodanie 20 μL 2x buforu ładującego SDS-PAGE (100 mM Tris-HCL pH 6,8, 4% dodecylosiarczan sodu, 0,2% (w/v) błękit bromofenolowy, 20% (v/v) glicerol i 200 mM β-merkaptoetanolu) i denaturować próbki w temperaturze 95 °C przez 5 minut.
3. Oddziel próbki na SDS-PAGE, przenieś oddzielone białka na błonę PVDF za pomocą półsuchego aparatu do transferu elektroforetycznego i przeanalizuj za pomocą Western blot przy użyciu przeciwciała anty-p53.
   1. Ustawić aparaturę żelową i załadować 20 μl próbki do studzienek żelowych.
   2. Uruchom 10% żel w stałym prądzie o napięciu 80 V przez około 120 minut (do momentu, gdy pasmo barwnika dotrze do dna żelu). Po zakończeniu elektroforezy wyłącz zasilanie.
   3. Odłączyć aparat żelowy i kasety z żelem, aby wyjąć żel, a następnie umieścić żel w półsuchym buforze transferowym (48 mM Tris-HCl, 39 mM glicyna, 20% metanolu) na 5 minut.
   4. Weź inny pojemnik i namocz membranę PVDF w metanolu na 1 minutę. Następnie wyjmij PVDF z metanolu i umieść w półsuchym buforze transferowym. Delikatnie mieszaj membranę przez 5 minut.
   5. Zdjąć pokrywę zabezpieczającą półsuchego aparatu elektroforetycznego.
   6. Wstępnie zwilż bibułę filtracyjną i przygotuj warstwę żelu na dolnej anodzie platynowej w następujący sposób: bibuła filtracyjna, membrana PVDF, żel i bibuła filtracyjna.
   7. Zabezpiecz płytkę katodową i osłonę bezpieczeństwa, a następnie uruchom blot przy stałym prądzie 15 V przez 90 minut. Wyłącz zasilanie, odłącz urządzenie półsuche i wyjmij membranę PVDF.
   8. Blokowa membrana PVDF z buforem blokującym (5% beztłuszczowego mleka w buforze TBST (137 mM NaCl2, 20 mM Tris-HCl, 0,1% detergentu B (patrz tabela materiałów), pH 7,6)) w temperaturze pokojowej przez 1 godzinę z 30 obr./min, wytrząsając za pomocą wytrząsarki orbitalnej.
   9. Hybrydyzować membranę PVDF z przeciwciałem anty-p53 rozcieńczonym (1:1 000) w buforze blokującym przez 12-16 godzin w temperaturze 4 °C z wytrząsaniem 30 obr./min przy użyciu mieszalnika zawiesinowego.
   10. Wyjmij membranę PVDF do pojemnika i włóż do TBST. Przepłukać membranę PVDF za pomocą TBST jeszcze dwukrotnie.
   11. Namocz membranę PVDF w TBST na 30 minut, wstrząsając 45 obr./min wytrząsaniem za pomocą wytrząsarki orbitalnej.
   12. Hybrydyzować błonę PVDF z przeciwciałem anty-króliczym sprzężonym z peroksydazą chrzanową (HRP) rozcieńczoną (1:4 000) w buforze blokującym przez 1 godzinę w temperaturze pokojowej z wytrząsaniem 30 obr./min przy użyciu mieszalnika zawiesinowego.
   13. Umyć membranę PVDF TBST 3 razy, jak opisano w kroku 3.4.10.
   14. Namocz membranę PVDF w TBST na 30 minut, wstrząsając 45 obr./min za pomocą mieszadła do zawiesiny. Usunąć TBST i dodać PBS, aby zachować membranę PVDF w temperaturze 4 °C przez okres do 12 godzin.
   15. Zmieszać odczynnik 1 i 2 (1:1) wzmocnionego substratu chemiluminescencyjnego (substratu ECL) (patrz tabela materiałów). Usuń membranę PVDF z PBS, krótko osusz ręcznikiem papierowym lub lekką wycieraczką, aby wchłonąć nadmiar wilgoci, a następnie natychmiast dodaj 400 μl odczynnika ECL na powierzchnię każdej membrany na 3-5 minut. Usunąć nadmiar odczynnika ECL przez krótkie osuszenie, ale nie dopuścić do całkowitego wyschnięcia membrany.
   16. Naświetl plamę za pomocą systemu obrazowania luminescencyjnego lub filmu autoradiograficznego.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
pFastBac	Invitrogen	Numer katalogowy: 10359-016	bakulowirusa o podwójnej ekspresji
Wektor pCR2.1-TOPO	Invitrogen		Wektor produktu PCR
kompetentna komórka E. coli DH5α	Biotechnologia drożdży	FYE678-80VL	kompetentne komórki A E. coli
E. coli DH10Bac	Invitrogen	Numer katalogowy: 10359-016	kompetentne komórki E. coli B
FugeneHD	Roche	4709705001	odczynnik do transfekcji
Opti-MEM	Gibco (firma Gibco)	31985062	Zmniejszona pożywka w surowicy
Ligaza T4	NOWA Anglia BioLabs	Zobacz materiał M0202S
CpoI (RsrII)	Thermo Scientific	Zobacz materiał ER0741
Bluo-gal	Thermo Scientific	Zobacz materiał B1690	Substrat galaktozydazy
Protokół IPTG	Sigma-Aldrich	I6758-1G
Medium dla owadów Grace	Gibco (firma Gibco)	11605094
Surowica bydlęca płodu	Gibco (firma Gibco)	10082147
Gentamycyna	Rybak termiczny	15750060
Ampicyliny	Sigma-Aldrich	A9393-25G
Kanamycyna	Sigma-Aldrich	Zobacz materiał K0254-20ML
Gentamycyna	Gibco (firma Gibco)	Numer katalogowy: 15710-064
tetracyklina	Sigma-Aldrich	87128-25G
Rosół LB	Merk	1.10285.0500
HEPESY	Sigma-Aldrich	H4034-100G
Zawartość NaCl	Sigma-Aldrich	S9888-5KG
Kcl	Merk	1.04936.1000
Na2HPO4	Sigma-Aldrich	S5136-500G
KH2PO4	J.T.Baker	3246-01
dodecylosiarczan sodu	Merk	1.13760.1000
β-merkaptoetanol	Bio-Rad	Numer katalogowy: 161-0710
TRIS (podstawa)	J.T.Baker	Nr kat. 4109-06
Mleko odtłuszczone	Fonterra
glicerol	J.T.Baker	2136-01
Tryton X-100	Amresco (angielski)	0694-1L	detergent A
Animacja 20	Amresco (angielski)	0777-500ML	detergent B
Roztwór Poloxameru 188	Sigma-Aldrich	Zobacz materiał P5556-100ML	detergent C
Inhibitor proteazy Tabletka koktajlowa	Roche	04 693 132 001
3x peptyd flagowy	Sigma	F4799
anty-FLAG m2 Koraliki magnetyczne	Sigma-Aldrich	Zobacz materiał M8823	Koraliki magnetyczne znakowane przeciwciałami
Zestaw SUMOlink SUMO-1	Aktywny motyw	Numer katalogowy: 40120	standardowy protokół SUMOylacji
Zestaw SUMOlink SUMO-2/3	Aktywny motyw	Numer katalogowy: 40220	standardowy protokół SUMOylacji
Zestaw do ekstrakcji żelu QIAquick	QIAGEN powiedział:	Numer katalogowy: 28704
Mini zestaw plazmidu QIAGEN	QIAGEN powiedział:	Numer katalogowy: 12123	Zestaw do ekstrakcji plazmidu
Rurki polipropylenowe	sokół	352059
szalka Petriego	sokół	351029
Podnośnik komórek	Corning	CNG3008
Wskazówka dotycząca ładowania	Sorenson BioScience	Numer katalogowy 28480
Powłoka PVDF	PerkinElmer powiedział:	NEF1002
Bibuła filtracyjna do bibuły	Bio-Rad	1703932
Aparat do mini żelu do płyt (Bio-Rad Mini Protean II Cell)	Bio-Rad	1658001 EDU
Trans-Blot SD Półsucha elektroforetyczna komórka transferowa	Bio-Rad	1703940
Pierce ECL Western Blotting (Zachodnia Blottacja)	Thermo	Numer katalogowy: 32106	Odczynnik ECL
mieszalnik zawiesinowy	Instrumenty laboratoryjne Digisystem Inc.	Zobacz materiał SM-3000
Wytrząsarka orbitalna	Instrumenty Kansin Co.	System operacyjny OS701
ImageQuant LAS 4000	GE Opieka zdrowotna	28955810
Obrazowanie biomolekularne	GE Opieka zdrowotna	28955810
Zobacz materiał SF9	Thermo Scientific	Zobacz materiał B82501
Przeciwciało anty-P53	Sygnalizacja komórkowa	Numer katalogowy #9282
przeciwciało anty-królicze	GE Opieka zdrowotna	NA934-1ML

powiedział: wektor powiedział: powiedział: