$$\rightleftharpoonup{xx}$$
$$\longleftharp{xx}$$,
$$\longrightharp{xx}$$,
1. Przygotowanie odczynnika
- Przygotować podłoże DMEM o niskiej fluorescencji do testów za pomocą czytnika fluorescencji mikropłytkowego. Mieszanka 25 mM glukozy, 0,4 mM glicyny, 0,4 mM argininy, 0,2 mM cysteiny, 4,0 mM glutaminy, 0,2 mM histydyny, 0,8 mM izoleucyny, 0,8 mM leucyny, 0,8 mM lizyny, 0,2 mM metioniny, 0,4 mM fenyloalaniny, 0,4 mM seryny, 0,8 mM treoniny, 0,078 mM tryptofanu, 0,4 mM tyrozyny, 0,8 mM waliny, 1,8 mM CaCl2, 0,81 mMMgSO4, 5,33 mM KCl, 44,0 mM NaHCO3, 110 mM NaCl, 0,9 mM NaH2PO4. Dostosować pH roztworu za pomocą HCl lub NaOH do pH 7,4. Wysterylizuj pożywkę przez filtrację.
nuta: Pożywka ta zawiera składniki standardowej pożywki DMEM o wysokiej zawartości glukozy, z wyjątkiem Fe(NO3)3, witamin i czerwieni fenolowej. Czerwień fenolowa, ryboflawina i pirydoksal w zwykłej pożywce hodowlanej DMEM znacząco zakłócają wykrywanie sygnału fluorescencji. Pożywka hodowlana bez tych składników ma kluczowe znaczenie dla udanego obrazowania GFP z żywych komórek. Pożywka jest stabilna przez 12 miesięcy, gdy jest przechowywana w lodówce.
2. Test degradacji NLS-lucyferazy-GFP w czasie rzeczywistym przy użyciu czytnika mikropłytek fluorescencyjnych
- Zasiać około 1 x 104 komórek HeLa na czarnych 96-dołkowych płytkach do hodowli tkankowych z przezroczystym dnem. Po hodowli O/N osiąga się konfluencję 50-70% w momencie transfekcji.
UWAGA: 60 μl podłoża zawierającego całkowicie zawieszone komórki HeLa wysiewa się bezpośrednio do każdej studzienki. Nie dodawaj dodatkowego podłoża ani płyty skalnej tam iz powrotem po wysianiu, w przeciwnym razie komórki mogą być nierównomiernie rozmieszczone.
- Transfekcję komórek HeLa z 0,05-0,1 μg plazmidu NLS-lucyferazy-GFP/pRK5 do każdej studzienki za pomocą odczynnika do transfekcji zgodnie z instrukcją producenta. Sporządzić główną mieszankę transfekcyjną zawierającą DNA i odczynnik do transfekcji i podzielić ją na porcje dla każdej studzienki. Trzy studzienki z komórkami nie są transfekowane DNA, które służy jako kontrola sygnału fluorescencji tła dla każdego warunku leczenia.
nuta: Alternatywnym sposobem na zmniejszenie zmienności transfekcji jest transfekcja komórek przed siewem. Jednak duża część komórek transfekowanych nieprawidłowo sfałdowanymi białkami nie przyłącza się lub wykazuje zmniejszoną żywotność przy użyciu tej metody. Jest prawdopodobne, że niektóre komórki mogą nie wytrzymać stresu spowodowanego trawieniem trypsyny podczas ekspresji toksycznych, nieprawidłowo sfałdowanych białek. W rezultacie ogólny sygnał fluorescencyjny jest znacznie zmniejszony.
- 20-24 godziny po transfekcji zbadaj żywe komórki pod odwróconym mikroskopem fluorescencyjnym pod kątem ekspresji GFP o długości fali wzbudzenia 450-490 nm.
- Usunąć pożywkę przez aspirację próżniową. Dodaj około 200 μl 1x PBS do każdej studzienki, a następnie odessaj ją, aby usunąć resztki pożywki DMEM.
- Dodać 60 μl pożywki DMEM o niskiej fluorescencji z 5% FBS i 50 μg/ml CHX. Aby zbadać degradację proteasomalną, należy włączyć dodatkowy inhibitor proteasomu MG132 (10 μM) do jednego zestawu próbek. Ustaw trzy dołki dla każdego zabiegu/stanu.
nuta: Leczenie MG132 jest włączone jako kontrola degradacji proteasomalnej, ponieważ ważne jest, aby wykluczyć inne czynniki, które mogą powodować spadek sygnału fluorescencji, w tym śmierć komórki i wygaszanie fluorescencji.
- Zmierz sygnał fluorescencji GFP natychmiast na czytniku płytek fluorescencyjnych po dodaniu CHX.
nuta: Ustawienia pomiarowe oprogramowania przedstawiono w tabeli 1.
- Odczytuj tabliczkę co godzinę przez maksymalnie 8-10 godzin. Po odczytaniu należy umieścić płytkę z powrotem w inkubatorze do hodowli komórkowych.
- Wyeksportuj dane jako plik arkusza kalkulacyjnego. Użyj średniej wartości wielokrotnych odczytów dla każdej studzienki jako intensywności fluorescencji. Znormalizuj wartości każdego punktu danych do średnich wartości czasu 0 w odpowiednich grupach. Wykreślić znormalizowaną intensywność fluorescencji w czasie, jak pokazano na rysunku 1A i 1B oraz na rysunku 2, prawe panele.
- Wykonaj analizę statystyczną szybkości degradacji między dwoma warunkami przy użyciu dwukierunkowej ANOVA z powtarzanymi pomiarami.
nuta: W tej analizie "intensywność fluorescencji" jest zmienną zależną, podczas gdy "warunki leczenia" i "czas" to dwa czynniki. Zamiast porównywać dane w poszczególnych punktach czasowych, dwukierunkowa ANOVA z powtarzanymi pomiarami analizuje różnicę między dwiema grupami leczenia w całym okresie czasu.
Tabela 1: Ustawienia pomiaru na czytniku mikropłytek fluorescencyjnych.
| Plik definicji płyty | GRE96fb powiedział: |
| Tryb pomiaru | Intensywność fluorescencji na dole |
| Długość fali | Długość fali wzbudzenia | 485 nm |
| Szerokość pasma wzbudzenia | 9 nm |
| Długość fali emisji | 535 nm |
| Szerokość pasma emisji | 20 mil morskich |
| Liczba błysków | 5 |
| Zysk | Instrukcja obsługi 200 |
| Czas integracji | 20 μs |
| Wiele odczytów na studnię | typ | Okrąg (wypełniony) |
| rozmiar | 5×5 |
| granica | 400 μm |
