Test przeciwciał neutralizujących AAV na bazie komórek: technika kolorymetryczna do wykrywania przeciwciał neutralizujących przeciwko specyficznym wirusom związanym z adenowirusami w surowicy

Streszczenie

Źródło: Bass-Stringer, S., et al. Metoda krok po kroku do wykrywania przeciwciał neutralizujących przeciwko AAV przy użyciu kolorymetrycznego testu opartego na komórkach. J. Vis. Exp. (2021)

W tym filmie demonstrujemy test kolorymetryczny in vitro do wykrywania obecności przeciwciał neutralizujących przeciwko wektorom rekombinowanego wirusa związanego z adenowirusem serotypu 6 (rAAV6) w próbkach surowicy owczej. Test wykorzystuje reakcję między AAV kodującym ludzki gen fosfatazy alkalicznej łożyska a jego substratem w celu wytworzenia nierozpuszczalnego fioletowego produktu.

Protokół

Wszystkie procedury dotyczące modeli zwierzęcych zostały sprawdzone przez lokalny instytucjonalny komitet opieki nad zwierzętami oraz weterynaryjną komisję rewizyjną JoVE.

Schematyczny przegląd protokołu testu znajduje się na rysunku 1.

1. Wstępne przygotowanie

1. Do oceny u owiec: zebrać krew w probówkach aktywujących skrzepy separatora surowicy o pojemności 8 ml (patrz tabela materiałów), pozostawić próbkę krwi w temperaturze pokojowej (RT) na 20-30 minut, a następnie wirować w temperaturze 2 100 x g przez 15 minut. Przezroczystym supernatantem, który tworzy się w górn....

Wyniki

Rysunek 1: Schemat ideowy protokołu testu NAb. (A) Wizualna reprezentacja testu NAb ilustrująca podstawowe kroki związane z protokołem trzydniowym. Krótko mówiąc, komórki są hodowane i platerowane przez noc. Następnego dnia przygotowuje się seryjne rozcieńczenia surowicy, inkubuje się je z AAV, a następnie inkubuje z komórkami przez noc. Następnego dnia komórki są utrwalane, myte, inkubowane, łączon.......

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
0,05% trypsyna/EDTA	Gibco (firma Gibco)	25300-054
Stożkowa probówka wirówkowa 50 ml	sokół	Numer katalogowy: 14-432-22	Lub równoważny
75 cm2 kolby kwadratowe	sokół	353136	Lub równoważny
96-dołkowa płyta z płaskim dnem	sokół	353072
Wektor AAV6-CMV-hPLAP			Laboratorium Badań i Terapii Mięśni (Uniwersytet w Melbourne, Australia) AAV6-CMV-hPLAP może być dostarczony na życzenie.
Folia aluminiowa
Mysie przeciwciało monoklonalne anty-AAV6 (nienaruszone cząstki) (ADK6)	PIERWOTNA	610159	Przeciwciało monoklonalne kontroli dodatniej
Protokół BCIP/NBT	SIGMAFAST (Szybki SIGMA)	Zobacz materiał B5655
Szafa bezpieczeństwa do hodowli komórkowych i tkankowych
Pipeta elektroniczna			Wkładki dla pasiaków 5 i 10 ml
Surowica bydlęca płodu	Gibco (firma Gibco)	Numer katalogowy: 10099-141
Hemocytometr
Zmodyfikowane podłoże Eagle Medium o wysokiej zawartości glukozy (DMEM)	Gibco (firma Gibco)	11965118
Ogniwa HT1080	Kontroler ATCC (Kontroler T
inkubator			37 °C, 5% CO2
Mikroskop świetlny z kamerą			Możliwość robienia zdjęć z obiektywem 4x
piekarnik			Do inkubacji w temperaturze 65 °C
Paraformaldehyd	Merck	30525-89-4
Kąpiel wodna
Penicylina Streptomycyna	Gibco (firma Gibco)	Rozdział 15140-122