$$\rightleftharpoonup{xx}$$
$$\longleftharp{xx}$$,
$$\longrightharp{xx}$$,
Wszystkie procedury dotyczące modeli zwierzęcych zostały sprawdzone przez lokalny instytucjonalny komitet opieki nad zwierzętami oraz weterynaryjną komisję rewizyjną JoVE.
Schematyczny przegląd protokołu testu znajduje się na rysunku 1.
1. Wstępne przygotowanie
- Do oceny u owiec: zebrać krew w probówkach aktywujących skrzepy separatora surowicy o pojemności 8 ml (patrz tabela materiałów), pozostawić próbkę krwi w temperaturze pokojowej (RT) na 20-30 minut, a następnie wirować w temperaturze 2 100 x g przez 15 minut. Przezroczystym supernatantem, który tworzy się w górnej części probówek, jest surowica. Klarowną fazę wodną przelać do probówek do mikrowirówek i przechowywać w temperaturze -80 °C.
nuta: Surowica w temperaturze -80 °C pozostaje stabilna przez ~5 lat. Krew pobierano z żyły szyjnej za pomocą igły 16 G (odcięta końcówka) i strzykawki od przytomnych zwierząt.
- Podgrzać inaktywowaną płodową surowicę bydlęcą (FBS), umieszczając ją w łaźni wodnej o temperaturze 56 °C na 30 minut i mieszać z przerwami. Dla precyzji umieść termometr w drugiej butelce zawierającej równoważną objętość wody i dodaj go do łaźni grzewczej w tym samym czasie, co butelkę FBS. Rozpocznij odmierzanie czasu, gdy termometr osiągnie 56 °C.
- Stosuj odpowiednią technikę aseptyczną i praktykę hodowli komórkowych dla wszystkich kolejnych etapów wykonywanych w kapturze do hodowli komórkowych. Przed użyciem spryskaj 70% etanolem wszystkie przedmioty i kaptur, a po zakończeniu wyczyść 1% podchlorynem sodu.
- Stwórz kompletną pożywkę Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM), łącząc DMEM o wysokiej stężeniu glukozy (4,5 g/l) (89%) z inaktywowanym termicznie FBS (10%) i penicyliną Streptomycyną (1%). Połączyć i przefiltrować za pomocą sterylnego systemu filtracji próżniowej (wielkość porów 0,22 μm, membrana polieterosulfonowa) (patrz tabela materiałów). Przechowywać kompletny DMEM zawinięty w folię w temperaturze 4 °C.
- Umieścić komórki HT1080 (patrz tabela materiałów) i przejść w kolbie o powierzchni75 cm 2 kwadratowe. Utwórz wiele zamrożonych zasobów komórek. Nie należy używać komórek po 20 pasażach, ponieważ dalsze pasażowanie może wpłynąć na wyniki testu.
2. Dzień 1 - Powlekanie komórek
- Przejście komórek HT1080, gdy osiągną ~80% konfluencji.
- Wstępnie podgrzej kompletny DMEM (przygotowany w kroku 1.4), 0,05% trypsyny-EDTA i 1x sól fizjologiczną buforowaną fosforanami (PBS) do temperatury 37 °C w łaźni wodnej. Usunąć pożywkę wzrostową z pasażowanych komórek za pomocą systemu aspiracji.
nuta: Wszystkie aspiracje w tym protokole wykorzystują system próżniowy z rurką podłączoną do sterylnej pipety serologicznej o pojemności 5 ml.
- Umyj komórki w 10 ml wstępnie podgrzanego (37 °C) 1x PBS i trypsynizuj komórki przez 3-4 minuty w 4 ml wstępnie podgrzanej 0,05% trypsyny-EDTA, aby odłączyć komórki od kolby.
- Dezaktywuj trypsynę, dodając 6 ml wstępnie podgrzanego kompletnego DMEM i pipetuj komórki do probówki o pojemności 50 ml. Obliczyć liczbę i stężenie żywotnych komórek za pomocą hemocytometru i metody wykluczania błękitu trypanowego.
- Rozcieńczyć komórki do stężenia 1 x 105 komórek/ml we wstępnie podgrzanym kompletnym DMEM. Wysiewaj 100 μl komórek/studzienkę do przezroczystych, 96-dołkowych, płaskodennych płytek (1 x 10,4 komórki na studzienkę). Inkubować płytkę w temperaturze 37 °C, 5% dwutlenku węgla (CO2 ) przez noc przez 16-22 godziny.
3. Dzień 2 - Zakażenie komórek
- Wyjąć płytkę (płytki) z inkubatora i użyć mikroskopu świetlnego, aby potwierdzić, że komórki są równomiernie rozproszone w studzienkach i że konfluencja wynosi ~50%. Jeśli komórki nie znajdują się w zakresie zbiegu 45%-55%, powtórz protokół "Dzień 1" i odpowiednio dostosuj początkowe stężenie komórek.
- Generować seryjne rozcieńczenia próbek surowicy będących przedmiotem zainteresowania w probówkach mikrowirówek o pojemności 1,5 ml, używając wstępnie podgrzanego kompletnego DMEM jako rozcieńczalnika. W tabeli 1 przedstawiono sposób wytwarzania kaskady rozcieńczania dla próbek pobranych z trzech egzemplarzy.
- Aby przeprowadzić test w trzech egzemplarzach, należy przygotować 7,5 x106 genomów wektorowych (vg)/μL roztworu roboczego AAV6-hPLAP (patrz tabela materiałów), rozcieńczając roztwór podstawowy wirusa w 1x PBS.
- Dodać 66 μl roztworu roboczego wirusa o sile 7,5 x 106 vg/μl do każdej probówki zawierającej 264 μl rozcieńczenia surowicy/pożywki (330 μl całkowitej objętości/rozcieńczenia, patrz tabela 1).
nuta: Jest to solidny test, który nie wymaga idealnych warunków hodowli. Jednakże, aby dokładnie określić ilościowo i zapewnić, że każda seria testów jest wiarygodna, konieczne jest uwzględnienie następujących elementów: (1) kontroli samego wirusa i pożywki, (2) kontroli tylko pożywki oraz (3) pozytywnej próbki kontrolnej NAb na wszystkich płytkach w tych samych warunkach doświadczalnych. Opisana objętość (330 μl) odpowiada trzykrotnym próbkom + 10% mieszaniny surowicy i wirusa. Wykonywanie powtórzeń jest wysoce zalecane w celu dokładnego określenia aktywności neutralizującej.
- Wymieszać rozcieńczenia wirusa/surowicy przez pipetowanie i umieścić probówki zawierające mieszaninę wirusa/surowicy w inkubatorze w temperaturze 37 °C, 5% CO2 na 30 minut, aby umożliwić potencjalną neutralizację.
- Odpipetować 100 μl mieszaniny wirus/surowica do każdego dołka na 96-dołkowej płytce zawierającej 1 x 104 komórek/basenik dla każdego rozcieńczenia.
nuta: W ten sposób wygeneruje się końcowe stężenie wirusa wynoszące 15 tys. wirusów/wielokrotność infekcji komórkowej (MOI) w każdym dołku. Tabela 2 zawiera przykładowy układ 96-dołkowych płytek do pomiaru próbek w rozcieńczeniu 1/512.
- Owinąć 96-dołkową płytkę zawierającą komórki, surowicę i AAV-hPLAP w folię i umieścić w inkubatorze w temperaturze 37 °C, 5% CO2 przez noc przez 16-24 godziny, aby umożliwić przedostanie się AAV do komórek.
4. Dzień 3 - Utrwalanie i dodawanie substratu do komórek
- Podgrzej podwielokrotność 1x PBS do temperatury 37 °C (~25 ml/płytka 96-dołkowa). Schłodzić oddzielne porcje PBS (~25 ml/96-dołkowa płytka) i podwójnie destylowaneH2O(DDW, ~25 mL/96-dołkowa płytka) do 4 °C. Rozpuścić osad BCIP/NBT (patrz Tabela materiałów) w 10 ml DDW w stożkowej probówce wirówkowej o pojemności 50 ml przez wirowanie (10 ml wystarcza na 2 x 96-dołkowe płytki).
- Odessać pożywkę z dołków 96-dołkowej płytki za pomocą pipety serologicznej lub podobnego elementu podłączonego do systemu aspiracji opartego na ssaniu lub odkurzacza pod wyciągiem. Delikatnie umieścić końcówkę pipety serologicznej w studzience i usunąć pożywkę, uważając, aby nie naruszyć przylegających komórek.
- Dodaj 50 μl RT 4% PFA do każdego dołka za pomocą pipety. Zawiń płytkę w folię i pozostaw ją w temperaturze RT na 10 minut, aby utrwalić komórki.
ostrożność: Paraformaldehyd (PFA) jest prawdopodobnym czynnikiem rakotwórczym i jest toksyczny w wyniku kontaktu ze skórą, oczami lub wdychania. Trzymaj w dygestorium z odpowiednim wyposażeniem ochrony osobistej oraz maską na twarz. Przygotuj świeży 4% PFA rozcieńczony w PBS (wymagane ~ 7 ml na 96-dołkową płytkę).
- Przemyć i odessać komórki za pomocą 200 μl RT 1x PBS. Powtórz ten krok dwukrotnie.
nuta: Pipeta wielokanałowa to wydajna opcja dla wszystkich etapów pipetowania.
- Odpipetować 200 μl wstępnie podgrzanego PBS do każdego dołka, owinąć płytkę folią i inkubować w temperaturze 65 °C przez 90 minut w celu denaturacji endogennej fosfatazy alkalicznej.
- Odessać studzienki i przemyć komórki 200 μl zimnego (4 °C) PBS. Ponownie odessać, przemyć 200 μl zimnego DDW i ponownie odessać.
- Odpipetować 50 μl rozpuszczonego BCIP/NBT (przygotowanego w kroku 4.1) do każdej studzienki.
- Owinąć płytkę w folię i inkubować w temperaturze pokojowej przez 2-24 godz.
nuta: Bądź konsekwentny w czasie inkubacji między biegami; Elastyczność czasowa pozwala użytkownikom fotografować studnie zarówno w dniu 3, jak i następnego dnia.
- Korzystając z kamery mikroskopu świetlnego, zrób zdjęcia każdej studzienki za pomocą soczewki obiektywowej 4x, upewniając się, że ta sama ekspozycja, balans bieli i ustawienia światła są konsekwentnie używane we wszystkich wykonywanych testach.
- Ustaw każdą studzienkę identycznie i upewnij się, że krawędzie studni nie są widoczne na zdjęciach. Zapisuj zdjęcia w formacie TIF lub podobnym.
nuta: Konkretne ustawienia będą się różnić w zależności od mikroskopu, ale oznaczanie ilościowe będzie najbardziej skuteczne, jeśli oświetlenie tła jest wysokie i spójne we wszystkich studzienkach (ryc. 1B).
Tabela 1: Objętości surowicy i rozcieńczalnika wymagane do wytworzenia seryjnych rozcieńczeń surowicy w trzech egzemplarzach.
Zobacz materiał
| Etykieta kaskadowa rozcieńczania | Rozcieńczeniu | 3 x próbka (240 μL) + 10% objętości buforu (24 μL) | Stosunek surowicy do podłoża |
| Rozcieńczenie 1 (D1) | 1/2 | 264 μL surowicy 264 μL podłoża | Godzina 50:50 |
| Rozcieńczenie 2 (D2) | 1/4 | 264 μL D1 + 264 μL | godz. 25:75 |
| Rozcieńczenie 3 (D3) | 1/8 | 264 μL D2 +264μL podłoża | 12.5:87.5 |
| Rozcieńczenie 4 (D4) | 1/16 | 264 μL D3 +264 μL podłoża | 6.25:93.75 |
| Rozcieńczenie 5 (D5) | 1/32 | 264 μL D4 +264 μL podłoża | 3.13:96.87 |
| Rozcieńczenie 6 (D6) | 1/64 | 264 μL D5 +264 μL podłoża | 1.56:98.44 |
| Rozcieńczenie 7 (D7) | 1/128 | 264 μL D5 +264 μL podłoża | 0.78:99.22 |
| Rozcieńczenie 8 (D8) | 1/256 | 264 μL D5 +264 μL podłoża | 0.39:99.61 |
| Rozcieńczenie 9 (D9) | 1/512 | 264 μL D7 + 264 μL podłoża | 0,2:99,8 |
| Rozcieńczenie 10 (D10) | 1/2048 | 132 μL D8 + 396 μL | 0.05:99.95 |
| Rozcieńczenie 11 (D11) | Numer katalogowy 1/8192 | 132 μL D9 + 396 μL podłoża | 0.01:99.99 |
| Rozcieńczenie 12 (D12) | 1/32768 | 132 μL D10 + 396 μL podłoża | 0.003:99.997 |
Tabela 2: Przykładowy układ płytki 96-dołkowej do oceny próbek surowicy naiwnej w rozcieńczeniach od 1/2 do 1/512. Wyższe rozcieńczenia są włączane do testu, jeśli ocenia się próbkę, o której wiadomo, że jest dodatnia pod kątem AAV NAbs (próbki po podaniu) lub jeśli wymagane jest wyższe miano. MO (-C): Sterowanie tylko za pomocą nośnika. VO (+C): Kontrola tylko wirusów i multimediów. mAb: Przeciwciało monoklonalne przeciwko AAV (kontrola pozytywna NAb).
Zobacz materiał
Zobacz materiał
Zobacz materiał
Zobacz materiał
Zobacz materiał
Zobacz materiał
Zobacz materiał
Zobacz materiał
Zobacz materiał
| Próbka surowicy #1 | Próbka surowicy #2 | Próbka surowicy #3 | Mono AB (mAB), kontrole i dodatkowe próbki |
| 1 | 2 | 3 | 4 | 5 | 6 | 7 | 8 | 9 | 10 | 11 | 12 |
| A | 1/2 | 1/2 | 1/2 | 1/2 | 1/2 | 1/2 | 1/2 | 1/2 | 1/2 | 50 ng
Mab | 50 ng
Mab | 50 ng
Mab |
| B | 1/4 | 1/4 | 1/4 | 1/4 | 1/4 | 1/4 | 1/4 | 1/4 | 1/4 | 5 ng
Mab | 5 ng
Mab | 5 ng
Mab |
| C | 1/8 | 1/8 | 1/8 | 1/8 | 1/8 | 1/8 | 1/8 | 1/8 | 1/8 | 0.5 ng
Mab | 0.5 ng
Mab | 0.5 ng
Mab |
| D | 1/16 | 1/16 | 1/16 | 1/16 | 1/16 | 1/16 | 1/16 | 1/16 | 1/16 | MO (-C) | MO (-C) | MO (-C) |
| E | 1/32 | 1/32 | 1/32 | 1/32 | 1/32 | 1/32 | 1/32 | 1/32 | 1/32 | VO (+C) | VO (+C) | VO (+C) |
| F | 1/64 | 1/64 | 1/64 | 1/64 | 1/64 | 1/64 | 1/64 | 1/64 | 1/64 | Sample
#1
1/512 | Sample
#1
1/512 | Sample
#1
1/512 |
| G | 1/256 | 1/256 | 1/256 | 1/256 | 1/256 | 1/256 | 1/256 | 1/256 | 1/256 | Sample
#2
1/512 | Sample
#2
1/512 | Sample
#2
1/512 |
| H | 1/512 | 1/512 | 1/512 | 1/512 | 1/512 | 1/512 | 1/512 | 1/512 | 1/512 | Sample
#3
1/512 | Sample
#3
1/512 | Sample
>#3
1/512 |
