$$\rightleftharpoonup{xx}$$
$$\longleftharp{xx}$$,
$$\longrightharp{xx}$$,
1. Przygotowanie pożywki wzrostowej, roztworu ofloksacyny i zapasów komórek E. coli
- Zwykła pożywka Luria-Bertani (LB): Dodać 10 g/l tryptonu, 10 g/l chlorku sodu (NaCl) i 5 g/l ekstraktu drożdżowego do wody dejonizowanej (DI). Wysterylizuj pożywkę przez autoklawowanie.
- Płytki agarowe LB: Dodaj 10 g/L tryptonu, 10 g/L NaCl, 5 g/L ekstraktu drożdżowego i 15 g/L agaru w wodzie DI i wysterylizuj pożywkę przez autoklawowanie. W żądanej temperaturze (~55 °C) wlej ~30 ml podłoża agarowego na kwadratowe płytki (10 x 10 cm). Wysuszyć płytki i przechowywać je w temperaturze 4 °C.
- Zmodyfikowane podłoże LB: Dodaj 10 g/l tryptonu i 5 g/l ekstraktu drożdżowego do wody demineralizowanej. Wysterylizuj pożywkę przez autoklawowanie.
- Zmodyfikowana pożywka LB zawierająca osmolit: Wymieszaj 2x zmodyfikowaną pożywkę LB z 2x roztworem osmolitu w równych objętościach. Aby przygotować 2x zmodyfikowane podłoże LB, dodaj 20 g/L tryptonu i 10 g/L ekstraktu drożdżowego do wody DI i sterylizuj w autoklawie. Aby przygotować 2x roztwór osmolitu, rozpuść interesujący Cię osmolit (2x ilość) w wodzie DI, a następnie przefiltruj roztwór wysterylizowany.
nuta: Osmolit będący przedmiotem zainteresowania i jego stężenia można określić na podstawie testów przesiewowych mikromacierzy fenotypu (patrz Protokół 4). Jednak badany osmolit i związane z nim stężenie 2x można dostosować w zależności od charakteru badania. Na przykład, aby zbadać wpływ 1 mM chlorku sodu, 2x roztwór osmolitu byłby 2 mM roztworem chlorku sodu.
- Roztwór podstawowy ofloksacyny (5 mg/ml): Dodać 5 mg soli ofloksacyny (OFX) w 1 ml wody demineralizowanej. Dodać 10 μl 10 M wodorotlenku sodu, aby zwiększyć rozpuszczalność OFX w wodzie, a następnie przefiltrować wysterylizować roztwór. Przygotować porcje i przechowywać w temperaturze -20 °C.
nuta: Ofloksacyna jest antybiotykiem chinolonowym, który jest szeroko stosowany zarówno w przypadku rosnących, jak i nierosnących komórek bakteryjnych14,21. Minimalne stężenie hamujące (MIC) OFX dla komórek E. coli MG1655 mieści się w zakresie 0,039–0,078 μg/ml. Należy również pamiętać, że inne antybiotyki, takie jak ampicylina i kanamycyna, są powszechnie stosowane w badaniach nad trwałością. Wybór antybiotyków zależy od charakteru badania.
- Zapasy komórek E. coli MG1655: Zaszczepić 2 ml zwykłej pożywki LB pojedynczą kolonią w probówce o pojemności 14 ml (z zatrzaskową nakrętką) i hodować komórki w wytrząsarce orbitalnej przy 250 obr./min i 37 °C. Gdy komórki osiągną fazę stacjonarną, zmieszać 500 μl kultury komórkowej z 500 μl 50% glicerolu (sterylnego) w fiolce kriogenicznej i przechowywać w temperaturze -80 °C.
2. Propagacja komórek w celu wyeliminowania wcześniej istniejących persisterów
- Aby przygotować hodowlę przez noc, zeskrob niewielką ilość komórek z zamrożonego materiału komórkowego za pomocą sterylnej końcówki pipety (nie rozmrażaj zapasu komórek gliceryny) i zaszczep komórki w 2 ml zmodyfikowanej pożywki LB w 14 ml probówce z zatrzaskową nakrętką. Hodować komórki w wytrząsarce orbitalnej przy prędkości 250 obr./min i temperaturze 37 °C przez 12 godzin.
- Pierwsza propagacja
- Po 12 godzinach przenieść 250 μl hodowli przez noc do 25 ml świeżo zmodyfikowanej pożywki LB w kolbie z przegrodami o pojemności 250 ml pokrytej sterylną folią aluminiową.
- Hodować kulturę komórkową w wytrząsarce orbitalnej z prędkością 250 obr./min i w temperaturze 37 °C, aż komórki osiągną środkową fazę wykładniczą (OD600 = 0,5).
- Mierzyć gęstość optyczną przy 600 nm (OD600) za pomocą czytnika mikropłytek co 30 minut.
- Druga propagacja
- Przy OD600 = 0,5 rozcieńczyć 250 μl hodowli komórkowej z pierwszej kolby na 25 ml świeżej modyfikowanej pożywki LB w kolbie z przegrodami o pojemności 250 ml.
- Hodować drugą kulturę komórkową w wytrząsarce orbitalnej z prędkością 250 obr./min i w temperaturze 37 °C, aż do OD600=0,5.
- Mierz gęstość optyczną co 30 min.
nuta: Hodowla nocna może zawierać znaczną ilość komórek trwałych. Opisana powyżej metoda rozcieńczania/cyklu wzrostu może być stosowana w celu wyeliminowania tych wcześniej istniejących substancji trwałych przed przeniesieniem komórek do mikromacierzy. Ich eliminacja może być zwalidowana poprzez ilościowe określenie poziomów trwałości kultur nocnych za pomocą testu opisanego w Protokole 3.
3. Walidacja eliminacji wcześniej istniejących komórek trwałych
- Po drugim rozmnażaniu (patrz krok 2.3) rozcieńczyć 250 μl kultury komórkowej (OD600 = 0,5) w 25 ml świeżej zmodyfikowanej pożywki LB w kolbie z przegrodami o pojemności 250 ml.
nuta: W przypadku kontroli rozcieńczyć 250 μl nocnej hodowli (patrz krok 2.1) w 25 ml świeżej zmodyfikowanej pożywki LB w kolbie z przegrodami o pojemności 250 ml. Przed przeniesieniem komórek do kolby, gęstość komórek w nocnej hodowli powinna być dostosowana w świeżej zmodyfikowanej pożywce LB w celu uzyskania OD600 = 0,5.
- Dodać 25 μl roztworu podstawowego OFX (5 mg/ml) do zawiesiny komórek i delikatnie wstrząsnąć kolbą, aby uzyskać jednorodność badanej hodowli. Końcowe stężenie OFX wynosi 5 μg/ml w kulturze testowej.
- Inkubować kulturę testową w wytrząsarce orbitalnej przy prędkości 250 obr./min i temperaturze 37 °C.
- Co godzinę podczas poddawania działaniu substancji (w tym 0 godzin, punkt czasowy przed dodaniem OFX do kultury testowej) przenieść 1 ml kultury testowej z kolby do probówki mikrowirówkowej o pojemności 1,5 ml.
- Odwirować kulturę testową w probówce mikrowirówki przy 17 000 x g przez 3 minuty.
- Ostrożnie usunąć 950 μl supernatantu, nie naruszając osadu komórkowego.
- Dodać 950 μl roztworu soli fizjologicznej buforowanej fosforanami (PBS) do probówki mikrowirówkowej.
- Powtórzyć kroki płukania 3,5-3,7 łącznie 3x, aż stężenie antybiotyku spadnie poniżej minimalnego stężenia hamującego (MIC).
- Po końcowym płukaniu ponownie zawiesić osad komórkowy w 100 μl roztworu PBS, uzyskując 10-krotnie zagęszczoną próbkę.
- Pobrać 10 μl zawiesiny komórek i seryjnie rozcieńczyć ją sześć razy w 90 μl roztworu PBS przy użyciu 96-dołkowej okrągłej płytki dennej.
- Umieścić 10 μl rozcieńczonych zawiesin komórkowych na świeżych płytkach agarowych bez antybiotyków. Aby zwiększyć granicę wykrywalności, pozostałe 90 μl zawiesiny komórek należy umieścić na świeżej płytce agarowej.
- Inkubować płytki agarowe w temperaturze 37 °C przez 16 godzin, a następnie policzyć jednostki tworzące kolonie (CFU). Uwzględnij współczynniki rozcieńczenia przy obliczaniu całkowitej liczby jtk w 1 ml kultury testowej. Krzywe zabijania są generowane przez wykreślenie logarytmicznych wartości CFU w odniesieniu do czasu trwania antybiotykoterapii.
nuta: 6-godzinna obróbka OFX jest wystarczająca do uzyskania dwufazowej krzywej zabijania komórek E. coli. Poziom trwałości rozmnożonych komórek (mierzony liczbą CFU po 6 godzinach) powinien być znacznie niższy niż w hodowli nocnej. Procedury opisane w Protokole 2 i 3 mogą być wykonywane przy użyciu zwykłego LB w zależności od projektu badawczego.
4. Ekrany płytkowe z mikromacierzą
- Przygotowanie kultur komórkowych w mikromacierzach
- Przenieść 250 μl komórek o fazie wykładniczej do 25 ml świeżo zmodyfikowanej pożywki LB w probówce wirówkowej o pojemności 50 ml. Delikatnie wymieszaj zawiesinę komórkową, aby uzyskać jednorodną konsystencję.
nuta: Ogniwa o fazie wykładniczej (OD600 = 0,5) uzyskuje się z drugiego etapu propagacji (patrz krok 2.3).
- Rozcieńczoną zawiesinę komórkową przenieść do sterylnego zbiornika o pojemności 50 ml.
- Za pomocą pipety wielokanałowej przenieś 150 μl zawiesiny komórek do każdej studzienki mikromacierzy, tj. 96-dołkowej płytki zawierającej różne osmolity.
nuta: Studnie, które nie mają osmolitów, służą jako kontrole.
- Przykryj mikromacierz membraną uszczelniającą przepuszczającą gaz.
- Inkubować płytkę w wytrząsarce orbitalnej w temperaturze 37 °C i prędkości obrotowej 250 obr./min przez 24 godziny
nuta: W eksperymentach tych wykorzystano dostępne na rynku płytki, takie jak mikromacierze fenotypowe (PM-9 i PM-10), które zawierają szeroką gamę osmolitów, pH i innych substancji chemicznych w stanie suchym w różnych stężeniach. Te mikromacierze są w formatach płytek 96-dołkowych o połowie powierzchni. Objętość kultur należy dostosować w zależności od rodzaju używanych płytek. Mikromacierze można również generować ręcznie.
- Ręczne przygotowanie płytek mikromacierzowych
- Przenieś 75 μl 2x roztworów osmolitu do studzienek płytki 96-dołkowej o połowie powierzchni.
- Przenieś 500 μl komórek o fazie wykładniczej do 25 ml 2x zmodyfikowanej pożywki LB w probówce wirówkowej o pojemności 50 ml. Delikatnie wymieszaj zawiesinę komórkową, aby uzyskać jednorodną konsystencję.
nuta: Szybkość inokulacji dostosowano tak, aby była zgodna z protokołem badań przesiewowych mikromacierzy opisanym w 4.1.
- Dodać 75 μl zawiesiny komórkowej do każdego dołka 96-dołkowej płytki o połowie powierzchni zawierającej 2x roztwory osmolitów.
- Inkubować płytkę w wytrząsarce orbitalnej w temperaturze 37 °C i prędkości obrotowej 250 obr./min przez 24 godziny.
- Przygotowanie płytek do oznaczania trwałości
- Przygotować 25 ml zmodyfikowanej pożywki LB zawierającej 5 μg/ml OFX w probówce wirówkowej o pojemności 50 ml i przenieść tę pożywkę do sterylnego zbiornika.
- Przenieść 190 μl zmodyfikowanej pożywki LB z OFX ze zbiornika do każdej studzienki ogólnej płaskodennej płytki 96-dołkowej (płytka do badania trwałego) za pomocą pipety wielokanałowej.
- Wyjąć mikromacierz z wytrząsarki (po 24 godzinach hodowli) i przenieść 10 μl kultur komórkowych z mikromacierzy do dołków płytki do oznaczania trwałości, zawierających zmodyfikowaną pożywkę LB z OFX.
- Pobrać 10 μl zawiesin komórkowych z płytki do oznaczania trwałości i seryjnie rozcieńczyć trzykrotnie w 290 μl roztworu PBS za pomocą okrągłodennej 96-dołkowej płytki i pipety wielokanałowej.
- Po seryjnym rozcieńczeniu, za pomocą pipety wielokanałowej umieścić 10 μl wszystkich seryjnie rozcieńczonych zawiesin komórkowych na świeżych płytkach agarowych bez antybiotyków.
- Inkubować płytkę do badania trwałości (przygotowaną w kroku 4.3.3) w wytrząsarce orbitalnej w temperaturze 37 °C i prędkości obrotowej 250 obr./min przez 6 godzin po pokryciu płytki membraną uszczelniającą przepuszczającą gaz.
- Po 6 godzinach inkubacji w wytrząsarce wyjąć płytkę do oznaczania trwałości i powtórzyć czynności opisane w pkt 4.3.4-4.3.5.
- Inkubować płytki agarowe przez 16 godzin w temperaturze 37 °C, a następnie policzyć jtk. Poziomy jtk przed i 6 godzin po antybiotykoterapii pozwalają na obliczenie frakcji trwałej w każdym dołku. Liczba CFU przed leczeniem OFX pomaga również ocenić wpływ osmolitów i na żywotność E. coli.