1. Pomiar spadku proteostazy w tkance mięśniowej za pomocą zwierząt wykazujących ekspresję poliglutaminy
UWAGA: Do identyfikacji spadku proteostazy w komórkach mięśniowych można użyć dwóch metod: obrazowania powstawania agregatów białkowych podczas starzenia się (1.1) i pomiaru proteotoksyczności, jaką te agregaty powodują z wiekiem poprzez nadejście paraliżu (1.2).
- Obrazowanie tworzenia agregatów poliglutaminy w mięśniach podczas starzenia
nuta: Zależną od wieku progresję agregacji białek w komórkach mięśniowych obrazuje się za pomocą powtórzeń poliglutaminy (polyQ) połączonych z białkiem fluorescencyjnym na żółto (YFP). Protokół ten określa użycie szczepu AM140 rmIs132[unc-54p::Q35::YFP], ale można również użyć innych szczepów wariantu poliglutaminy. Transgen polyQ::YFP ulega ekspresji w mięśniach za pomocą promotora specyficznego dla mięśni unc-54. Zsynchronizowane zwierzęta wyrażające ekspresję YFP unc-54p::p olyQ::YFP są wizualizowane w 1, 2, 3 i 4 dniu dorosłości. Aby zobrazować agregaty unc-54p::p olyQ::YFP, użyj mikroskopu złożonego wyposażonego w fluorescencyjny mikroskop lub fluorescencyjny mikroskop preparacyjny. AM140 jest dostępny w Caenorhabditis Genetics Center (CGC) pod adresem: https://cgc.umn.edu/strain/AM140
- W dniach obrazowania (1., 2., 3. i 4. dzień dorosłości) wybierz 20 zwierząt i umieść je na szkiełku mikroskopowym z 3% podkładką agarozową i kroplą 5 μl 10 mM azydku sodu (rozcieńczonego w buforze M9).
- Po unieruchomieniu wszystkich zwierząt przez azydek sodu (~ 5 minut), wyobraź sobie całe ciała zwierząt za pomocą soczewki o 10-krotnym powiększeniu (ryc. 1A). Do obrazowania należy użyć filtra FITC i takiej samej ekspozycji dla każdego zwierzęcia. Odrzuć slajdy po obrazowaniu.
nuta: Alternatywnie, ogniska YFP można również określić ilościowo bezpośrednio na płytkach, ale ruch musi być zahamowany poprzez nałożenie strumienia dwutlenku węgla na płytkę podczas nacinania. Ta alternatywna metoda jest najbardziej odpowiednia w przypadku badań przesiewowych w dużej liczbie schorzeń.
- Po uzyskaniu obrazów policz liczbę ognisk w mięśniach ściany ciała całego zwierzęcia. Ogniska to jaśniejsze sygnały punktowe, które można odróżnić od ciemniejszego sygnału rozpuszczalnego w tle.
- Wykreśl progresję akumulacji ognisk YFP od dni 1, 2, 3 i 4. Wykreśl wykres XY, gdzie X reprezentuje dni dorosłości, a Y reprezentuje liczbę ognisk unc-54p::p olyQ::YFP (rysunek 1B). Liczba ognisk w warunkach doświadczalnych (np. obniżenie lub nadekspresja genów) jest porównywana ze zwierzętami kontrolnymi. Przeprowadź analizę statystyczną między grupami w każdym punkcie czasowym obserwowanym dla każdego badania.
- Porównując liczbę ognisk tylko dla dwóch warunków, należy wykonać niezależny test t próbki w każdym punkcie czasowym.
- Porównując liczbę ognisk dla więcej niż dwóch warunków, należy przeprowadzić zbiorczą jednokierunkową analizę ANOVA dla każdego punktu czasowego, w tym dane dla wszystkich warunków w tym punkcie czasowym. Jeśli ANOVA omnibus daje znaczącą wartość p (tj. p < 0,005), należy przeprowadzić analizę post-hoc z parami niezależnych testów t próby w celu określenia konkretnych warunków, między którymi wykryto znaczącą różnicę w ogniskach (np. dla grup A, B i C porównaj A i B, A i C oraz B i C).
2. Pomiar wskaźników paraliżu zwierząt jako substytut toksyczności poliglutaminy w komórkach mięśniowych
UWAGA: Zależny od wieku wzrost agregatów polyQ w mięśniach powoduje spadek funkcji mięśni, które napędzają lokomocję. Ten defekt w poruszaniu się można określić, mierząc postępujące tempo paraliżu u zwierząt z ekspresją polyQ. W teście paraliżu zsynchronizowane zwierzęta z ekspresją YFP unc-54p::p olyQ::YFP są oceniane w 3., 5., 7. i 9. dniu dorosłości. W razie potrzeby dodaj dodatkowe punkty czasowe, aby rozszerzyć zakres punktacji, tak aby można było ocenić efekt perturbacji genetycznej.
- W dniach punktacji (3, 5, 7 i 9 dzień dorosłości) spójrz na 6-centymetrowe tabliczki zawierające 50 zwierząt i zapisz liczbę sparaliżowanych zwierząt. Usuń sparaliżowane zwierzęta z talerza. Jeśli zwierzęta wypełzły z talerza lub zdechły, powinny zostać ocenzurowane; Zapisz zdarzenie, aby można je było uwzględnić w analizie.
nuta: Zwierzę uważa się za sparaliżowane, gdy po wystawieniu go na działanie lekkich lub delikatnych bodźców dotykowych nie obserwuje się żadnego ruchu. Aktywność pompowania gardła służy do określenia, czy zwierzęta nieporuszające się są żywe, czy martwe.
- Po zakończeniu eksperymentu oblicz współczynnik paraliżu dla każdego stanu. Zrób to w każdym punkcie czasowym, dzieląc frakcję sparaliżowanych zwierząt przez całkowitą liczbę zwierząt obserwowanych w tym stanie. W przypadku obserwacji wielu płytek na warunek w danym punkcie czasowym (tj. płytek replikowanych) należy obliczyć stosunek oddzielnie dla każdej kontrpróby.
- Wykreśl postęp szybkości paraliżu na wykresie XY (wykres rozrzutu). X oznacza dni dorosłości, a Y oznacza wskaźniki paraliżu. Współczynnik paraliżu zwierząt unc-54p::p olyQ::YFP porównuje się ze zwierzętami kontrolnymi (ryc. 1C). Przeprowadzanie analiz statystycznych między grupami; W przypadku wielu badań należy traktować je niezależnie. Użyj regresji proporcjonalnego hazardu Coxa i testu Walda. Większość narzędzi do analizy danych, które obsługują analizę przeżycia, obsługuje również modelowanie Coxa.
- Przekształć dane: każdy warunek powinien mieć dwie kolumny, jedną dla czasu, a drugą dla "zdarzenia". W każdym obserwowanym punkcie czasowym dodaj wiersz z "0" dla każdego sparaliżowanego zwierzęcia i "1" dla każdego ocenzurowanego zwierzęcia. Łączna liczba rzędów powinna być równa liczbie zwierząt wyjściowych na tablicy dla tego warunku.
- Wykonaj modelowanie proporcjonalnych hazardów Coxa, a następnie test Walda, zgodnie z instrukcjami oprogramowania statystycznego. Model jednowymiarowy będzie odpowiedni dla typowych projektów eksperymentalnych. W przypadku więcej niż dwóch warunków, jeśli test z uwzględnieniem wszystkich warunków wskazuje na istotny wynik (tj. p < 0,005), można przeprowadzić testy parami między warunkami w celu określenia określonej znaczącej pary (par) warunków.
nuta: Model Coxa opiera się na założeniu, że warunki testowe modulują prawdopodobieństwo zdarzenia proporcjonalnie w czasie. Oznacza to na przykład, że model Coxa nie byłby odpowiedni do porównywania stanu, w którym większość zwierząt jest sparaliżowana w dniu 1, ze stanem, w którym większość zwierząt jest sparaliżowana w dniu 9. Rozszerzenia modelu Coxa i inne podejścia do porównywania proporcji sparaliżowanych w każdym punkcie czasowym są dostępne dla przypadków, w których założenie proporcjonalnego hazardu nie jest prawdziwe.
