Test koinkubacji bakterii: technika oparta na mikroskopii fluorescencyjnej do wizualizacji wewnątrzgatunkowej konkurencji bakteryjnej na poziomie pojedynczej komórki

Streszczenie

Źródło: Smith, S., et al., Kwantyfikacja konkurencji międzybakteryjnej za pomocą obrazowania fluorescencji pojedynczej komórki. J. Vis. Exp. (2021).

Ten film demonstruje metodę opartą na mikroskopii fluorescencyjnej do badania konkurencji bakterii na poziomie pojedynczej komórki. Metoda ta dostarcza informacji na temat struktury i funkcji społeczności bakteryjnych.

Protokół

1. Równoczesne szczepy bakteryjne

1. Wybierz dwa szczepy bakteryjne do testów konkurencji bakterii jednokomórkowych. W tym przypadku stosuje się dwa szczepy V. fischeri: szczep docelowy (ES11424) i szczep inhibitorowy (MJ1125), o którym wiadomo, że zabija szczep docelowy za pomocą systemu wydzielania typu VI na chromosomie II (T6SS2)1, który jest mechanizmem zabijania zależnym od kontaktu.
2. Transformacja szczepów ze stabilnymi plazmidami kodującymi geny dla różnych białek fluorescencyjnych (np. GFP lub RFP), aby wizualnie rozróżnić typy szczepów pod mikroskopem. W tym przypadku szczep inhibitora jest znakowany plazmidem kodującym GFP (pVSV102), a szczep docelowy jest znakowany plazmidem kodującym dsRed (pVSV208).
3. Rozpocząć od hodowli mid-log dla obu szczepów, zmierzyć i zapisać gęstość optyczną przy 600 nm (OD₆₀₀) dla wszystkich próbek.
4. Normalizować każdą próbkę do OD₆₀₀ = 1,0, co odpowiada około 10⁹ jtk/ml dla V. fischeri, rozcieńczając kulturę pożywką LBS.
5. Wymieszaj dwa konkurujące ze sobą szczepy w stosunku 1:1 w zależności od objętości, dodając 30 μl każdego znormalizowanego szczepu do oznakowanej probówki o pojemności 1,5 ml. Wirować kulturę mieszanego szczepu przez 1-2 s.
   nuta: W niektórych przypadkach właściwe może być mieszanie kokultur w różnych proporcjach. Na przykład, gdy jedna odmiana rośnie znacznie szybciej niż druga, może być konieczne rozpoczęcie wolniej rosnącej odmiany z przewagą liczebną, aby obserwować konkurencję. Optymalizacja może być również wymagana, jeśli OD₆₀₀ nie odpowiada podobnym jtk/ml dla obu szczepów.
6. Powtórzyć krok 1.5 dla każdej kontrpróby biologicznej i poddania działaniu substancji. W przedstawionym przykładzie spowoduje to powstanie w sumie czterech probówek ze szczepem mieszanym: dwóch kontrprób biologicznych ze szczepem inhibitora typu dzikiego zmieszanym ze szczepem docelowym i dwóch powtórzeń biologicznych ze zmutowanym szczepem systemu wydzielania typu VI zmieszanym ze szczepem docelowym.
7. Aby upewnić się, że konkurujące ze sobą komórki są wystarczająco gęste do zależnego od kontaktu zabijania w kopolimeryzacji na podkładce agarowej, należy zagęścić każdą mieszaną kulturę 3-krotnie, odwirowując zmieszaną kulturę w standardowej probówce wirówkowej o pojemności 1,5 ml przez 1 minutę przy 21 130 x g, odrzucając supernatant i ponownie zawieszając każdą osadkę w pożywce o pojemności 20 μl LBS. Powtórz te czynności dla każdej próbki.
   nuta: Niektóre komórki bakteryjne są wrażliwe na uszkodzenia przez wirowanie przy wysokim rcf; W takich przypadkach mieszaną kulturę można odwirowywać przez 3 minuty przy 4600 x g. Dodatkowo, przy ilościowym określaniu konkurencji zależnej od kontaktu, ważne jest, aby zapewnić wystarczającą gęstość komórek na szkiełku, aby obserwować zabijanie. W tym artykule "zatłoczone" zabiegi, w których obserwuje się zabijanie, miały około 10 komórek/20^μm2.

2. Ustawienia slajdów

1. W przypadku korzystania z mikroskopu pionowego umieść podkładkę agarozową o średnicy ~5 mm² na standardowym szkiełku podstawowym o średnicy 1 mm. Umieść 2 μl mieszanej kultury na podkładce agarozowej i umieść szkiełko nakrywkowe #1,5 (25 mm²) na miejscu. Zobacz rysunek 1B.
2. Używając mikroskopu odwróconego, umieść 2 μl mieszanej kultury na dnie #1.5 szkiełka nakrywkowego szalki Petriego o średnicy 35 mm i umieść podkładkę agarozową ~5 mm² nad miejscem inkubacji. Umieść okrągłe szkiełko nakrywkowe o średnicy 12 mm na waciku agarozowym. Przykład znajduje się na rysunku 1C.
3. Powtórz kroki 2.1 lub 2.2, w zależności od użytego ustawienia mikroskopu, dla pozostałych trzech mieszanych kultur, w wyniku czego zostaną zobrazowane cztery szkiełka lub szalki.
4. Pozwól slajdom usiąść na blacie przez około 5 minut przed kontynuowaniem. Dzięki temu komórki mogą osiąść na podkładce agarowej i wyeliminować ruch podczas procesu obrazowania.

3. Mikroskopia fluorescencyjna

1. Zacznij od skupienia się na komórkach za pomocą światła białego (kontrast fazowy lub DIC), aby zminimalizować efekty wybielania fotograficznego. W oparciu o średnią wielkość pojedynczej komórki bakteryjnej użyj obiektywu olejowego 60x lub 100x.
2. Dostosuj czas ekspozycji i ustawienia akwizycji dla każdego kanału, tak aby komórki były widoczne w odpowiednim kanale przy minimalnym wykrywaniu tła.
   nuta: Właściwe jest stosowanie różnych czasów narażenia dla różnych kanałów, ale ten sam czas narażenia powinien być stosowany w odniesieniu do wszystkich kontrprób biologicznych i poddanych działaniu substancji w odniesieniu do danego kanału.
3. Dla każdej próbki wybierz co najmniej pięć pól widzenia (FOV) i uzyskaj obrazy w każdym odpowiednim kanale, korzystając z ustawień akwizycji (patrz przykłady na rysunku 2). Zapisz punkty XY z każdego pola widzenia, aby można było zobrazować to samo pole widzenia w ostatnim punkcie czasowym. Obrazowanie tego samego pola widzenia w każdym punkcie czasowym jest konieczne do określenia proporcji obszaru zajmowanego przez komórki docelowe lub inhibitorowe podczas etapów analizy.
   nuta: W tym przykładzie fluorescencja GFP jest wykrywana za pomocą filtra o długości fali wzbudzenia 467 - 498 nm i filtra emisyjnego 513 - 556 nm i jest fałszywie zabarwiona na zielono. Fluorescencja dsRed jest wykrywana za pomocą filtra o długości fali wzbudzenia 542 - 582 nm i filtra emisyjnego 603 - 678 nm i jest fałszywie zabarwiona w kolorze magenta.
4. Po 2 godzinach powtórz powyższy krok dla każdej próbki, używając wcześniej zapisanych punktów XY (Rysunek 2).
   nuta: Czas wykonywania kolejnych obrazów może wymagać optymalizacji dla organizmów o różnym tempie wzrostu lub mechanizmach konkurencyjnych.

Wyniki

Rycina 1: Przygotowanie podkładki agarozowej i ustawienie szkiełek do testów coincubation. (A) Zestaw do produkcji 2% wacików agarozowych. Pięć warstw taśmy laboratoryjnej (zielonej) jest owiniętych wokół szkiełka nakrywkowego w dwóch punktach oddalonych od siebie o około 20 mm. Następnie ciepłą 2% agarozę w morskiej soli fizjologicznej buforowanej fosforanami (żółtą) pipetuje się m...

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
1,5 ml probówka do mikrowirówek	rybak	05-408-129
Pipeta jednokanałowa 10 μl
Pipeta jednokanałowa 1000 μl
Pipeta jednokanałowa 20 μl
Pipeta jednokanałowa 200 μl
Agarozy	rybak	Zobacz materiał BP165-25	Agaroza o niskiej temperaturze topnienia
Talerz Cellvis 35 mm	rybak	NC0409658	#1.5 szklane dno pokrywy
chloramfenikol	Sigma	Zobacz materiał C0378	zapas (20 mg/ml w etanolu); końcowe stężenie w pożywce (2 μg /mL LBS)
Oprogramowanie do analizy obrazu FIDŻI	ObrazJ	https://imagej.net/Fiji/Downloads	Oprogramowanie typu open source
Okulary nakrywkowe Fisherbrand: koła	rybak	12-545-81P	#1.5 Szkło nakrywkowe; Średnica 12 mm
Siarczan kanamycyny	rybak	Zobacz materiał BP906-5	bulion (100 mg/ml w wodzie, sterylizacja filtra); końcowe stężenie w pożywce (1 μg/mL LBS)
Bibułka do czyszczenia soczewek	rybak	Zobacz materiał S24530
Płytki Petriego	rybak	FB0875713	sterylne z pokrywką
Żyletki	rybak	Numer katalogowy S65921
Kuwety półmikro	Firma VWR	97000-586
Spektrofotometr
Thermo Scientific Gold Seal Zwykłe szkiełka mikroskopowe	rybak	12-518-100 mld
Thermo Scientific Richard-Allan Naukowe szkło osłonowe	rybak	22-050-235	#1.5 Szkło nakrywkowe, 25 mm2
Olejek immersyjny typu F	rybak	NC0297589
Pionowy lub odwrócony mikroskop fluorescencyjny z kamerą i oprogramowaniem do obrazowania			Zdjęcia w tym artykule zostały uzyskane za pomocą odwróconego mikroskopu fluorescencyjnego Nikon TI-2 wyposażonego w kamerę ORCA-Fusion Digital CMOS przy użyciu oprogramowania NIS-Elements.
wir
Kąpiel wodna			Służy do utrzymywania ciepła agarozy przed pipetowaniem
Nośniki LBS
1M bufor Tris (pH ~ 7,5)			50 ml 1 M bufor podstawowy (62 ml HCl, 938 ml wody DI, 121 g zasady Trizma)
Agar techniczny	rybak	DF0812-17-9	15 g (dodać tylko do talerzy)
Woda DI			950 ml
chlorek sodu	rybak	Zobacz materiał S640-3	20 gramów
Trypton	rybak	BP97265	10 gramów
Ekstrakt drożdżowy	rybak	Zobacz materiał BP9727-2	5 gramów
mPBS (morski PBS)			Solanka buforowana fosforanami z dodatkiem soli morskich; stosowana do wyrobu watworki agarozowej
10 razy więcej kanałów na sekundę	rybak	ICN1960454
Błyskawiczna sól morska oceaniczna	Natychmiastowy ocean	Zobacz materiał SS1-160P	Dostosuj stężenie do odpowiedniego zasolenia; 20 zasilaczy używanych tutaj
Sterylne filtry próżniowe	rybak	SCGVU01RE	Służy do filtrowania i sterylizacji mPBS
Pompa próżniowa			Służy do filtrowania i sterylizacji mPBS