Amplifikowany luminescencyjny test jednorodny zbliżeniowy: Test zbliżeniowy oparty na kulkach do badania przesiewowego małych cząsteczek hamujących interakcje białko-białko

Streszczenie

Źródło: Wang, L. et al., Badania interakcji Chaperon-Cochaperone przy użyciu jednorodnego testu opartego na kulkach. J. Vis. Exp. (2021)

W tym filmie pokazujemy test jednorodności zbliżeniowej ze wzmocnioną luminescencją - test zbliżeniowy oparty na koralikach. Wykorzystuje kulki akceptora i dawcy o jednorodnej wielkości, unieruchomione dwoma białkami, które mają tendencję do oddziaływania w celu przesiewania potencjalnych małych cząsteczek hamujących interakcje białek.

Protokół

UWAGA: Przegląd tego protokołu jest pokazany na rysunku 1.

1. Ekspresja i oczyszczanie GST-FKBP51 i GST-FKBP52 (Rysunek 1A)

1. Plazmidy
   UWAGA: Uzyskaj klony cDNA dla ludzkiego FKBP51 (identyfikator klonu: 5723416) i dla ludzkiego FKBP52 (identyfikator klonu: 7474554) z konsorcjum IMAGE.
   1. Amplifikować ludzkie DNA FKBP51 metodą PCR za pomocą starterów (do przodu; 5'GGATCCATGACTACTGATGAAGGT-3', do tyłu; 5'-CTCGAGCTATGCTTCTCTCTCCAC-3') zawierających zwisy BamHI i XhoI i sklonować do wektora pGEX6-1 w miejscach restrykcji BamHI / XhoI.
   2. Amplifikować ludzkie DNA FKBP52 metodą PCR za pomocą starterów (do przodu; 5'-GAATTCATGACAGCCGAGGAGATG-3', do tyłu; 5'-CTCGAGCTATGCTTCTCTCTCCAC-3') zawierających zwisy EcoRI i XhoI i sklonować do wektora pGEX6-2 w miejscach ograniczeń EcoRI / XhoI.
      nuta: Układ i warunki reakcji PCR przedstawiono w Tabelach 1 i Tabeli 2.
   3. Sprawdź wstawioną sekwencję i przekształć plazmidy w chemicznie kompetentną E. coli zgodnie z protokołem wytwarzania.
2. Ekspresja i oczyszczanie białek
   1. Dodaj 25 g bazy bulionowej Luria (LB) do 1 l wody destylowanej, aby uzyskać roztwór LB. Autoklawować w temperaturze 121 °C przez 15 min. Po schłodzeniu dodać 50 μg/ml ampicyliny.
   2. Weź kolonię bakterii wykazujących ekspresję GST-FKBP51 lub GST-FKBP52 i wymieszaj z 500 μl roztworu LB w probówce o pojemności 1,5 ml. Wir.
   3. Dodać mieszaninę "1.2.2" do 1 l roztworu LB w kolbie Erlenmeyera pokrytej folią aluminiową. Inkubować kolbę Erlenmeyera w wytrząsarce przez noc w temperaturze 37 °C.
   4. Indukować ekspresję białka przez dodanie 1 mM izopropylo-β-D-tiogalaktozydu (IPTG) do kolby Erlenmeyera i kontynuować inkubację przez kolejne 2 godziny.
   5. Aby uzyskać granulki komórek, odwirować przy 5 000 x g przez 15 minut. Usunąć supernatant.
      nuta: Granulki komórkowe mogą być przechowywane w temperaturze -20 °C.
   6. Zawiesić granulki komórkowe w 40 ml PBS i poddać sonifikacji 3 x 20 s na lodzie. Dodaj 1 mM PMSF, 1 mM EDTA i koktajl inhibitorów proteazy (1 tabletka), aby zapobiec proteolizie.
   7. Odwirować zawiesinę przez 30 minut 50 000 x g w celu usunięcia resztek komórek i nanieść supernatant na kolumnę pułapki GST o pojemności 5 ml.
   8. Po przemyciu kolumny 30 ml PBS, wymyj GST-FKBP51 i GST-FKBP52 5 ml 10 mM glutationu w PBS.
   9. Skoncentruj białka na 15 ml 10 000 MWCO jednostce wirówkowej. Aby usunąć wolny glutation, przepuść koncentraty przez kolumnę PD-10 zrównoważoną 0,5x PBS i ponownie skoncentruj się na urządzeniu wirówkowym z filtrem.
   10. Zbierz frakcje zawierające białko. Sprawdź białka w SDS-PAGE i dostosuj stężenie białka do 1 mg/mL.
       nuta: Typowa wydajność białka wynosi 2-5 mg/L. Białko może być przechowywane w temperaturze -20 °C.

2. Sprzężenie peptydu C-końcowego Hsp90 z koralikami akceptorowymi (Rysunek 1B)

1. Preparat peptydowy Hsp90
   1. Zsyntetyzuj dziesięć peptydów aminokwasowych NH 2-EDASRMEEVD-COOH odpowiadających aminokwasom 714-724 ludzkiej izoformy beta Hsp90 (UniProt ID: P08238) za pomocą usługi syntezy peptydów.
   2. Rozcieńczyć peptyd Hsp90 w PBS do stężenia 1 mg/ml.
2. Przygotowanie koralików akceptorowych
   1. Rozcieńczyć niesprzężone kulki akceptorowe w PBS do stężenia 1 mg/ml i przenieść do probówki o pojemności 1,5 ml.
   2. Przemywać przez odwirowanie przy 16 000 x g przez 15 minut. Ostrożnie usunąć sklarowany osad.
3. koniugacja
   1. Ustaw stosunek między kulkami a peptydem na 10:1. Do probówki o pojemności 1,5 ml zawierającej 1 mg granulki perełki akceptorowej (przygotowanej w sposób opisany powyżej) dodać 1 ml PBS (pH 7,4), 0,1 mg rozcieńczonego peptydu, 1,25 μl Tween-20, 10 μL 400 mM roztworu cyjanoborowodorku sodu (NaBH₃CN) w wodzie.
      ostrożność: NaBH₃CN jest toksyczny; Używaj dygestorium i rękawic. Roztwór NaBH₃CN powinien być świeżo przygotowany
   .
   2. Inkubować przez 24 godziny w temperaturze 37 °C z mieszaniem od końca do końca (10-20 obr./min) na wytrząsarce obrotowej.
4. Hartowanie reakcyjne i mycie kulek
   1. Dodać 20 μl 1 M roztworu Tris-HCl (pH 8,0) do reakcji, aby zablokować miejsca, w których nie podano reakcji. Inkubować przez 1 godzinę w temperaturze 37 °C.
   2. Wirować przy 16 000 x g (lub maksymalnej prędkości) przez 15 minut w temperaturze 4 °C. Usunąć supernatant i ponownie zawiesić granulkę w 1 ml roztworu Tris-HCl (100 mM, pH 8,0).
   3. Powtórz krok prania trzy razy.
   4. Po ostatnim odwirowaniu ponownie zawiesić kulki w stężeniu 1 mg/ml w buforze do przechowywania (1 ml 0,5 × PBS z 0,01% azydkiem sodu jako środkiem konserwującym). Przechowywać sprzężony roztwór kulki akceptorowej w temperaturze 4 °C light protected.
      ostrożność: Azydek sodu jest toksyczny; Używaj dygestorium i rękawic.

3. Test badający interakcję między GST-FKBP51 lub GST-FKBP52 a C-końcowym peptydem Hsp90 oraz inhibicję związkami o małej masie cząsteczkowej (Rysunek 1C)

1. Białka znakowane GST oddziałujące z kulkami donorowymi glutationu
   1. Ustaw reakcje w płytkach 384-dołkowych.
   2. Przygotować roztwór zawierający 10 μg/ml kulek donorowych glutationu w 0,5x PBS, pH 7,4,
      nuta: Po dłuższym przechowywaniu koraliki osiadają i muszą być wirowane.
   3. Dodaj GST-FKBP51 lub GST-FKBP52 do końcowego stężenia 10 μg/ml.
   4. Inkubować w ciemności w temperaturze 25 °C przez 10 min.
      nuta: Na tym etapie białka oznaczone GST będą wchodzić w interakcje z glutationem przyczepionym do kulek. Na każdą studzienkę zostanie użyte 22,5 μl tej mieszaniny. Stężenie związków wiążących musi być określone empirycznie. Miareczkować GST-FKBP51 i GST-FKBP52 i wybrać stężenie, które daje najlepszy sygnał.
2. Dodawanie związków
   1. Wykonać seryjne rozcieńczenia badanych związków w DMSO.
      nuta: Stosowane stężenia to zazwyczaj 10, 30, 100, 300, 1,000 i 3,000 μM.
   2. Dodaj 0,25 μl DMSO (kontrola ujemna) lub peptydu C-końcowego Hsp90 (kontrola pozytywna, 30 μM) lub związków w DMSO do rogu każdej studzienki płytki. Stosować trzykrotnie dla każdego stężenia związku.
   3. Do każdej studzienki dodać 22,5 μl roztworu zawierającego kulki donorowe glutationu z białkami oznaczonymi GST.
   4. Delikatnie potrząśnij talerzem ręką, ale dokładnie. Inkubować w ciemności w temperaturze 25 °C przez 15 min.
      nuta: W tym czasie związki będą oddziaływać z domeną TPR w miejscu wiązania peptydu C-końcowego Hsp90.
3. Dodawanie koralików akceptorowych
   1. Rozcieńczyć kulki akceptora z dołączonym peptydem C-końcowym Hsp90 do 100 μg/ml w 0,5x PBS.
   2. Dodać 2,25 μl rozcieńczonych kulek akceptorowych do każdej studzienki.
   3. Wymieszaj delikatnie, ale dokładnie. Inkubować w ciemności w temperaturze 25 °C przez 15 min.
      nuta: Na tym etapie kulki donorowe i akceptorowe zbliżają się do siebie przez interakcje białko-peptyd. Końcowa objętość mieszaniny reakcyjnej wynosi 25 μl. W związku z tym końcowe stężenia związków wahają się od 0,1 do 30 μM.
4. Odczyt tabliczki
   nuta: Odczytać tabliczkę za pomocą czytnika tabliczek ustawionego w odpowiednim trybie.
   1. Włącz instrument i otwórz oprogramowanie
   2. Wybierz odpowiedni protokół.
   3. Kliknij opcję Edytuj mapę płyty i wybierz studnię używaną w płycie do pomiaru.
   4. Kliknij przycisk Dalej, aby kontynuować i uruchomić wybrany protokół.
   5. Po pomiarze kliknij Pokaż wyniki, aby wyświetlić wyniki.
   6. Eksportuj dane.

Tabela 1: Reakcja PCR ustawiona dla ludzkiej amplifikacji DNA FKBP51 i FKBP52.

Składnik reakcji	Objętość (μL)
Bufor PCR (5 x koncentrat)	4
Podkład do przodu	1
Odwrócony podkład	1
Plazmid	0,5
Mieszanka dNTP (10 mM każdy)	0,5
Polimeraza DNA Phusion	0,5
Woda (klasa DNA)	Rozdział 12,5
łączny	20

Tabela 2: Warunki termocylera dla ludzkiej amplifikacji DNA FKBP51 i FKBP52.

scena	Temperatura (°C)	Godzina	Cykli
Początkowa denaturacja	94 Rozdział 94	Czas trwania: 3 min	1
denaturacja	94 Rozdział 94	30 sekund	35
Wyżarzanie	56 Rozdział 56	30 sekund
rozszerzenie	72 Rozdział 72	1 min
Końcowe przedłużenie	72 Rozdział 72	Czas trwania: 5 min	1
Uwaga: Temperatura pokrywy wynosi 105 °C.

Wyniki

Rysunek 1: Schemat tego protokołu. (A) Ekspresja i oczyszczanie GST-FKBP51 i GST-FKBP52. (B) Sprzężenie peptydu C-końcowego Hsp90 z koralikami akceptorowymi. (C) Test badający interakcję między GST-FKBP51 lub GST-FKBP52 a C-końcowym peptydem Hsp90. Hamowanie związkami o małej masie cząsteczkowej.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
Płytki 384-dołkowe	Perkin Elmer	6008350	Objętość oznaczenia: 25 ml
Wirówka Amicon 10.000 MWCO	Milipory	UFC901008	Koncentrat białkowy
Ampicyliny	Sigma	Certyfikat A0166	antybiotyki
Wytrząsarka bakteryjna Unimax 1010	Heidolph		Hodowla bakterii
Klony cDNA dla ludzkiego FKBP51	Źródło: BioScience	Identyfikator klonu: 5723416	Grafika wektorowa: pCMV-SPORT6
Klony cDNA dla ludzkiego FKBP52	Źródło: BioScience	Identyfikator klonu: 7474554	Grafika wektorowa: pCMV-SPORT6
Chemicznie kompetentna E. coli	Invitrogen	C602003	Jeden strzał BL21 Gwiazda (DE3)
Dmso	Supelco powiedział:	1.02952.1000	Rozcieńczone związki
DPBS (Polskie Biuro Obsługi	Gibco (firma Gibco)	Nr kat. 14190-144	Przygotuj rozwiązanie
Edta	Calbiochem (Elektrownia Jądrowa)	344504	Zapobiegaj proteolizie podczas sonikacji
glutation	Sigma	G-4251	Elute białka znakowane GST
Koraliki donorowe glutationu	Perkin Elmer	Numer katalogowy: 6765300	Koralik dawcy
Kolumna pułapki GST	Cytiva (GE Healthcare)	17528201	Oczyszczanie białek oznaczonych GST
Izopropylo-β-D-tiogalaktozyd	Thermo Fisher Naukowy	Czynnik R0392	Indukuj ekspresję białka
Rosół LB (młynarz)	Sigma	L3522	Pożywka do wzrostu drobnoustrojów
Aparat do PCR	BIO-RAD	Termocykler S1000	Amplifikacja/PCR
Kolumna PD-10	Cytiva (GE Healthcare)	17085101	Wymiana rozwiązań
Wektor pGEX-6P-1	Cytiva (GE Healthcare)	28954648	Plazmid
Wektor pGEX-6P-2	Cytiva (GE Healthcare)	28954650	Plazmid
Czytnik płytek	Perkin Elmer	Czytnik wielu etykiet EnSpire 2300	Odczyt płyty alfa
Oprogramowanie do odczytywania tabliczek rejestracyjnych	Perkin Elmer	Menedżer EnSpire	Oprogramowanie do odczytywania tabliczek rejestracyjnych
Protokół oprogramowania czytnika tablic	Perkin Elmer	Alpha 384-well Niska objętość	Użyj tego protokołu do odczytu tabliczki
PMSF (Kanał PMSF)	Sigma	Zobacz materiał P7626	Zapobiegaj proteolizie podczas sonikacji
koktajl inhibitorów proteazy	Sigma	Zobacz materiał S8830	Zapobiegaj proteolizie podczas sonikacji
Azydek sodu	Sigma	S2002	Jako środek konserwujący
Sicyjanoborowodorek sodu (NaBH3CN)	Sigma	156159	Aktywuje matrycę do sprzężenia
Dziesięć peptydów aminokwasowych NH2-EDASRMEEVD-COOH odpowiadających aminokwasom 714-724 ludzkiej izoformy beta Hsp90	Peptyd 2.0 inc		Zsyntetyzuj peptyd C-końcowy Hsp90
Rotator probówki	LABINCO (LABINCO		Rób zamieszanie od końca do końca
Tris-HCl	Sigma	10708976001	Blokuj niezareagowane miejsca koralików akceptujących
Tween-20 (Kanał Telewizyjny)	Sigma	Zobacz materiał P1379	Zapobiegaj agregacji koralików
Wirówka Avanti J-20 XP	Beckman Coulter		Wirówka, aby uzyskać granulki komórek bakteryjnych
Ultradźwiękowy zakłócacz komórek	Mikroon		Sonikacja komórek w celu uwolnienia białka
Niesprzężone koraliki akceptorowe	Perkin Elmer	6762003	Koraliki akceptorowe
Minikomórka XCell SureLock i moduł XCell II Blot	Invitrogen	Numer EI0002	STRONA SDS

powiedział: Klienta powiedział: rejestracyjnych powiedział: ) powiedział: