1. Zasiewanie komórek Vero
- Dzień przed rozpoczęciem testu płytki nazębnej trypsynizuj komórki Vero i ponownie zawieś je w zwykłym zmodyfikowanym pożywce Dulbecco Eagles Medium (DMEM) i suplementuj zgodnie ze standardową metodologią hodowli komórek. Ponownie zawiesić trypsynizowane komórki w 10 ml DMEM na kolbę T-75 zlewających się komórek Vero (~107 komórek).
UWAGA: DMEM jest używany do testów płytek miażdżycowych zamiast alfa-MEM, ponieważ nieznacznie spowalnia tempo wzrostu komórek i sprzyja lepszym wynikom testów płytek.
- Policz komórki preferowaną metodą (np. standardowym hemocytometrem z wykluczeniem błękitu trypanowego).
- Wysiewaj komórki w 4 x 106 komórek/płytkę; w przypadku HSV-2 użyj 6-dołkowych płytek z 2,5 ml DMEM (z suplementami) na dołek; a w przypadku HSV-1 użyj 12-dołkowych płytek z 1,25 ml DMEM (z suplementami) na dołek.
UWAGA: Liczba komórek powinna być stała niezależnie od użytej płytki, chociaż rozmiar studzienek ma znaczenie dla dokładności w teście płytki nazębnej. Istotne jest, aby komórki były równomiernie rozmieszczone, co można najskuteczniej osiągnąć, przesuwając płytkę do przodu i do tyłu, a nie w sposób okrężny.
- Pozostawić komórki do wzrostu przez noc w temperaturze 37 °C/5% CO2 w wilgotnym inkubatorze.
UWAGA: Wilgotność utrzymuje się za pomocą naczynia z wodą destylowaną zawierającą algicyd na dnie inkubatora.
2. Rozcieńczenie próbki
- Zakończ rozcieńczanie próbki i dodawanie wirusa do komórek podczas jednej sesji laboratoryjnej.
UWAGA: HSV-1 i -2 są zakaźne dla ludzi i muszą być obsługiwane w odpowiednim zabezpieczeniu biologicznym (BSL-2). Wszystkie materiały, które mają kontakt z wirusem, należy przechowywać oddzielnie i zdezynfekować czynnikiem czwartorzędowym o rozcieńczeniu 1/256 (patrz Tabela materiałów), jodoforem, wybielaczem lub silnym detergentem jonowym (np. SDS) przed wyjęciem ich z komory bezpieczeństwa biologicznego.
- Dzień po wysiewie komórek Vero, seryjnie rozcieńcz każdą próbkę wirusa, która ma zostać pokryta płytką w 1x PBS; zazwyczaj stosuje się 10-krotne rozcieńczenia w celu najbardziej precyzyjnego śledzenia.
- Rozcieńczenia te należy przeprowadzić przez 10-4 (dla niskich stężeń wirusów) lub przez 10-9 (dla oczekiwanych próbek o wyższym mianie), pozostawiając co najmniej 1 ml każdej próbki do samego testu płytki.
- Przechowywać wszystkie rozcieńczenia wirusa na lodzie (nie dłużej niż 1 godzinę) do momentu, gdy będą gotowe do dodania tych rozcieńczonych próbek wirusa do komórek.
3. Dodanie wirusa do komórek
- Usunąć pożywkę do hodowli komórkowych z jednego lub dwóch dołków za pomocą pipety.
UWAGA: Nie używaj aspiratora, ponieważ usuwa on zbyt dużo płynu z monowarstwy komórek i wysusza komórki. Jedną z kluczowych kwestii jest zapewnienie, że monowarstwa komórkowa pozostaje nawodniona przez cały czas trwania eksperymentu. Jeśli komórki wyschną, w ostatnim kroku zmyją płytkę i wygenerują bezużyteczne dane. Dlatego przetwarzaj tylko jedną lub dwie studzienki na raz, aby zmniejszyć tę możliwość.
- Ostrożnie dodać rozcieńczoną próbkę wirusa (100-400 μl i 50-200 μl próbki wirusa stosuje się odpowiednio do płytek 6-dołkowych i 12-dołkowych) kroplami do każdej monowarstwy, dodając krople po boku każdej studzienki. Powtarzaj proces dla każdego jednego lub dwóch dołków, aż cała płytka zostanie wypełniona próbkami wirusa, które są płytkowane.
UWAGA: Dodanie kropli do środka studzienki może przypadkowo złuszczyć komórki z podłoża.
- Delikatnie kołysz ręcznie całą płytkę, aby upewnić się, że PBS zawierający wirusa pokrywa całą monowarstwę komórek w każdym dołku, a następnie umieść płytkę w inkubatorze CO2 w temperaturze 37 °C, aby umożliwić adsorpcję wirusa.
- Co 10 minut w ciągu 1 godziny wyjmować płytkę z inkubatora, delikatnie ją ponownie kołysać, aby wirus rozprzestrzeniał się bardziej równomiernie w każdym dołku, a następnie umieszczać ją z powrotem w inkubatorze.
UWAGA: Każdy eksperyment będzie dyktował liczbę powtórzeń i jakie rozcieńczenia są używane; Preferencje czytelnika dyktują tę decyzję.
- Aby zmniejszyć możliwość przypadkowego zliczenia niewchłoniętego inokulum, należy usunąć próbkę wirusa ze studzienek za pomocą końcówek do pipet o pojemności 1000 μl i umieścić ją w zlewce na odpady.
UWAGA: Ponownie, ta procedura jest przeprowadzana tylko z jednym lub dwoma dołkami na raz, aby utrzymać nawodnienie monowarstwy komórek.
- Umieścić 2,5 ml nakładki metylocelulozowej (rozpuścić 5% metylocelulozy w/w w 100 ml PBS, autoklawować przez 15 minut w temperaturze 121 °C i 15 psi w cyklu cieczowym, następnie dodać 375 ml DMEM plus 25 ml FBS).
- Gdy cała płytka zawiera nakładkę, umieść ją z powrotem w inkubatorze, aby umożliwić wzrost przez dwa dni.
UWAGA: Jeśli wirus i komórki mogą rosnąć przez trzy dni, nawet w DMEM plus suplementy, może dojść do znacznej utraty komórek w monowarstwie, co może zagrozić ostatecznym danym.
- Zdezynfekuj zlewkę na odpady, zwykle z dodatkiem wybielacza, jodoforu lub podobnego środka wirusobójczego, przed wyjęciem jej z szafki bezpieczeństwa biologicznego.
4. Barwienie płytek nazębnych
- Po dwudniowej inkubacji usunąć nakładkę metylocelulozy za pomocą pipety, ponownie po jednym lub dwóch dołkach na raz i umieścić ją w zlewce na odpady.
- Dodaj ~ 2 ml 1% fioletu krystalicznego (patrz Tabela materiałów) w 50% etanolu do każdego dołka, aby zabarwić płytki.
UWAGA: Nie jest konieczne usuwanie każdej ostatniej kropli nakładki.
- Inkubować płytkę ze wszystkimi studzienkami wypełnionymi plamą przez 30 minut w temperaturze 37 °C. W tym momencie należy zdezynfekować zlewkę na odpady, jak opisano powyżej w kroku 3.8.
- Energicznie umyj talerze wodą z kranu, aż spływ będzie czysty.
UWAGA: Delikatny strumień wody nie jest wystarczająco energiczny; Wymagane jest pełne ciśnienie z uchwytu zlewozmywaka laboratoryjnego.
- W tym momencie należy upewnić się, że istnieją około 10-krotne różnice w liczbie blaszek w każdej serii rozcieńczeń.
- Pozostaw płytki do wyschnięcia przez noc do góry nogami, po czym można policzyć poszczególne płytki.
