Wszystkie procedury dotyczące modeli zwierzęcych zostały sprawdzone przez lokalny instytucjonalny komitet opieki nad zwierzętami oraz weterynaryjną komisję rewizyjną JoVE.
1. Test TUNEL
- Poddaj eutanazji zwierzęta, które wykazują kliniczne objawy chytridiomykozy i równą liczbę zwierząt z kontroli ujemnej Bd.
- Przeanalizuj próbki skóry (grzbietowej, brzusznej i udowej) od każdego zwierzęcia. Utrwal próbki skóry przez 2 godziny w formaldehydzie buforowanym fosforanem o stężeniu 4% v/v. Krótki i stały czas utrwalania pozwala na pełne utrwalenie tkanek, ale także pozwala na skuteczne i dokładne barwienie immunohistochemiczne. Następnie przenieś do 80% etanolu aż do zatopienia w celu podziału.
- Zanurzyć skórę w wosku parafinowym w celu przygotowania histologicznego zgodnie ze standardowymi metodami. W skrócie protokół jest następujący:
- Odwodnić tkanki w stopniowanej serii etanolu i usunąć etanol za pomocą ksylenu. Zanurz tkankę w wosku parafinowym i umieść wszystkie trzy próbki skóry dla każdej osoby w jednym bloku parafiny.
- Wyciąć skórę za pomocą mikrotomu zgodnie ze standardowym przygotowaniem histologicznym. Tkankę należy podzielić szeregowo na 5 μm, a następnie przymocować ją do szkiełek hydrofilowych. Umieść cztery seryjne histosekcje dla każdego typu skóry na szkiełku. Wykonaj trzy preparaty na osobę z seryjnymi sekcjami skóry, pamiętaj, że każdy szkiełko ma przymocowane cztery sekcje każdej tkanki.
- Zabejcuj szkiełka w następującej kolejności:
- Wybarwić pierwsze szkiełko hematoksyliną, a następnie przeciwbarwieniem eozyny (H&E). Ten slajd ma na celu wizualizację lokalizacji zarodni Bd w skórze.
- Wybarwić drugi szkiełko za pomocą dostępnego w handlu testu TUNEL do przygotowania histologicznego i postępować zgodnie z instrukcjami producenta, które opisano poniżej.
- Najpierw należy odparafinować skrawki tkanki w słoiku z kopeliną, myjąc szkiełka trzema zmianami ksylenu przez 5 minut na pranie, a następnie dwiema zmianami 100% etanolu przez 5 minut każde mycie. Następnie wykonaj jedno płukanie 95% etanolem przez 3 minuty, a następnie 70% etanolem przez 3 minuty. Na koniec nakładaj jedno pranie PBS przez 5 minut.
- Wstępnie potraktować tkankę świeżo rozcieńczonym enzymem trawiącym białka (proteinaza K w stężeniu 20 μg/ml rozcieńczonym w PBS) i dodać bezpośrednio do szkiełka. Pozostawić do inkubacji na 15 minut. Umyć z dwiema zmianami PBS w słoiku z kopeliną przez 2 minuty każda.
- Strzepnąć nadmiar płynu i schować w 3,0% nadtlenku wodoru w PBS w słoiku z kopeliną przez 2 minuty w temperaturze pokojowej. Spłukać dwukrotnie PBS, przez pięć minut przy każdym myciu.
- Stuknąć nadmiar płynu, a następnie nanieść 75 μl/5cm2 buforu równowagi bezpośrednio na tkankę na szkiełku. Inkubować przez 10 s. Strzepnąć nadmiar płynu wokół sekcji i nałożyć 55 μl/5cm2 działającego końcowego enzymu deoksynukleotydylotransferazy (TdT). Inkubować w wilgotnej komorze przez 1 godzinę w temperaturze 37 °C.
- Po inkubacji TdT umieścić szkiełko w słoiku z kopinem o sile roboczej buforu zatrzymującym/płukającym, mieszać przez 15 s i inkubować przez 10 minut w temperaturze pokojowej. Umyj szkiełko trzema zmianami PBS przez 1 minutę na pranie. Strzepnij nadmiar płynu.
- Nałóż koniugat anty-digoksygeniny (rodamina), który został podgrzany do temperatury pokojowej do tkanki, 65 μl/5 cm2. Inkubować w wilgotnej komorze przez 30 minut w temperaturze pokojowej i unikać ekspozycji na światło. Prać z czterema zmianami PBS przez 2 minuty na pranie. Strzepnij nadmiar płynu.
- Na koniec dodaj 15 μl 0,5 - 1 μg/ml DAPI (4',6-diamidino-2-fenyloindole) w podłożu do mocowania szkiełka do szkiełka, które działa jak przeciwbarwnik. Następnie przykryj szkiełkiem nakrywkowym i uszczelnij lakierem do paznokci lub cementem gumowym. Pozostaw szkiełka do wyschnięcia w ciemności, ponieważ test jest wrażliwy na światło.
- Wybarwić trzeci szkiełko za pomocą testu TUNEL i barwienia przeciwwłaściwego DAPI, ale użyć jako kontroli dodatniej i ujemnej dla każdej próbki.
UWAGA: Spośród 4 histosekcji na szkiełkach kontrolnych, pierwsze 2 to kontrpróby kontroli dodatniej, a ostatnie 2 to kontrpróby kontroli ujemnej.
- W przypadku kontroli dodatnich, zamiast kroku 1.5.2.2, należy wstępnie potraktować tkankę buforem DN (zasada trizma 30 mM, pH 7,2, 4 mM MgCl2, 0,1 mM DDT) i pozostawić do inkubacji w temperaturze pokojowej przez 5 minut. Następnie rozpuść Dnazę I w buforze DN do końcowego stężenia 0,1 ug/ml i nałóż ją bezpośrednio na szkiełko. Inkubować przez 15 minut w temperaturze pokojowej. Następnie umyć szkiełko 5 płukaniami dH2O przez 3 minuty przy każdym myciu. Zetrzyj nadmiar płynu. Następnie wznowić test TUNEL zgodnie z zaleceniami w sekcji 1.5.2.3.
- W przypadku kontroli ujemnych nie należy dodawać do tych próbek końcowego enzymu deoksynukleotydylotransferazy (TdT) (jak opisano w sekcji 1.5.2.4).
2. Obserwuj slajdy TUNEL natychmiast po zakończeniu testu.
- Rób zdjęcia w losowych odstępach czasu wzdłuż każdego odcinka skóry z 200-krotnym powiększeniem za pomocą mikroskopu fluorescencyjnego, używając filtrów zarówno dla barwienia rodaminy, które ujawnia komórki apoptotyczne i wydaje się czerwone, jak i DAPI, które ujawnia wszystkie jądra i wydaje się niebieskie, aby można było wygenerować nakładkę komórek. Upewnij się, że co najmniej 100 komórek zostało sfotografowanych na każdy fragment skóry na próbkę. Preparaty należy przechowywać w ciemnym pojemniku mikroskopowym w temperaturze -20 °C.
- Policz komórki (zabarwione na niebiesko DAPI) na obrazie. Upewnij się, że na każdy odcinek skóry liczy się co najmniej 100 komórek. Aby osiągnąć 100 komórek, policz wszystkie komórki na obrazie. Jeśli na jednym obrazie znajduje się mniej niż 100 komórek, policz kolejny obraz, aż osiągniesz co najmniej 100 komórek na odcinek skóry na zwierzę.
- Następnie policz liczbę komórek TUNEL-dodatnich na tych samych obrazach (rodamina barwiona na czerwono). Komórki TUNEL-dodatnie, które wskazują na apoptozę, a nie martwicę lub tło, są pojedynczymi komórkami z wyraźnymi krawędziami komórek (błony są nienaruszone bez lizy). Czasami komórki kurczą się, tworząc ciała apoptotyczne.
- Zlokalizuj obszary zliczone w teście TUNEL i przeanalizuj odpowiadające im regiony na histosekcjach barwionych H&E. Upewnij się, że skrawki wybarwione H&E odpowiadają miejscom zakażenia Bd, co zapewnia, że miejsca zakażone Bd są używane podczas liczenia komórek apoptotycznych w teście TUNEL.
