Wszystkie procedury związane z modelami zwierzęcymi zostały sprawdzone przez lokalny komitet ds. opieki nad zwierzętami oraz komisję weterynaryjną JoVE.
1. Hodowla i monitorowanie zwierząt
- Zwierzęta trzymane w domu indywidualnie, w środowisku odpowiednim dla gatunku, z odpowiednim harmonogramem nawadniania, karmienia i czyszczenia. Codziennie sprawdzaj zwierzęta.
- Wykorzystać dorosłe osobniki zagrożonej Litoria verreauxii alpina (do testu kaspazy 3/7, sekcja 4), pochodzące z obiektów hodowlanych w niewoli. Utrzymuj zwierzęta w temperaturze 15 - 18 °C, na podłożu z mchu i żwiru, codziennie spryskuj je wodą z odwróconej osmozy i karm je 3 razy w tygodniu świerszczami z jelitami.
- Zbieraj dane o każdej osobie raz w tygodniu. Pobrać wymaz od osób pod kątem Bd zgodnie z opisem w kroku 2.1. Zważ każde zwierzę z dokładnością do 0,1 g za pomocą wagi i zmierz długość pyska do otworu wentylacyjnego (SVL) z dokładnością do 0,01 mm za pomocą suwmiarki zegarowej.
- Po zaszczepieniu (zgodnie z opisem w sekcji 3) należy codziennie badać zwierzęta pod kątem klinicznych objawów infekcji (nieregularne złuszczanie się skóry, brak apetytu, zaczerwienienie nóg, letarg lub opóźniony odruch prostowania) zgodnie z wytycznymi etycznymi dla zwierząt. Poddaj zwierzęta eutanazji, jeśli występują objawy kliniczne i zachorowalność.
- Poddać eutanazji z przedawkowaniem metanosulfonianu trikainy (MS222) (0,1% w/v MS222 do pH 6 - 7 z wodorowęglanem sodu w dojrzałej wodzie z kranu). Trzymaj zwierzęta w MS222 przez 10 minut po ustaniu wszelkiego ruchu i nie wykazują one żadnej reakcji na bodźce.
2. Testy na infekcję Bd
- Wymaz na Bd
- Wymaz z każdego zwierzęcia za pomocą nowego sterylnego wacika ze sztucznego jedwabiu (jeden wacik na zwierzę). Użyj następującej metody pobierania wymazów: pięć razy na wietrze i pięć razy na każdym udzie, boku i kończynie. Daje to w sumie 45 uderzeń.
- Delikatnie obracaj wacik podczas i między pociągnięciami, aby zapewnić skuteczne wychwytywanie DNA. Rozbij końcówkę wacika do probówek mikrowirówek o pojemności 1,5 ml i przechowuj w temperaturze -20 °C do momentu ekstrakcji.
- Ekstrakcja DNA i test qPCR
- Ekstrahować genomowe DNA z wacików, dodając 50 μl dostępnego w handlu odczynnika do ekstrakcji DNA z 30 - 40 mg kulek krzemionkowych o średnicy 0,5 mm. Kulki ubijały próbki w bijaku do bijaków z maksymalną prędkością przez 2 minuty. Po etapie ubipania kulek odwirować próbki o masie 2 000 x g przez 1 minutę.
- Próbki inkubować w temperaturze 100 °C przez 10 minut i pozostawić do ostygnięcia. Odwirować próbki o masie 5 000 x g przez 3 minuty, a następnie przenieść supernatant do pojedynczych probówek mikrowirówek o pojemności 1,5 ml i przechowywać w temperaturze -20 °C do momentu qPCR.
- Użyj ilościowego PCR (qPCR) zgodnie z Boyle i in. 2004, aby przeanalizować obciążenie infekcją. Użyj następujących modyfikacji:
- Rozcieńczyć próbki do ekstrakcji DNA w stosunku 6:100 podwójnie dejonizowaną wodą. Dodaj 0,7 μl albuminy surowicy bydlęcej (BSA) do każdego dołka, aby zapobiec zahamowaniu PCR. Uruchom każdą próbkę pojedynczo. Na każdej płytce należy zastosować kontrolę ujemną (bez szablonu) i kontrolę pozytywną z szeregiem wzorców rozcieńczeń w celu oszacowania obciążenia zoosporami (infekcją).
3. Szczepienie
- Kultura Bd
- Przygotuj bulion hodowlany, dodając 16 g tryptonu, 2 g hydrolizatu żelatyny i 4 g laktozy (TGHL) do 1 l wody dejonizowanej. Autoklaw (121 °C przez 40 min) i pozostawić bulion do ostygnięcia.
- Zaszczepić izolat Bd (w tym przypadku wyizolowany z izolatu Nowej Południowej Walii, AbercrombieR-L.booroologensis-2009-LB1, Passage number 11) w bulionie TGHL i rosnąć przez 7 dni w temperaturze 23 °C, a następnie przenieść kulturę bulionową na płytki agarowe TGHL.
- Aby przygotować płytki, dodaj 16 g tryptonu, 2 g hydrolizatu żelatyny, 4 g laktozy (TGHL) i 10 g agaru bakteriologicznego do 1 l wody dejonizowanej i autoklawu (121 °C przez 40 min). Gdy mieszanina ostygnie na tyle, aby można ją było dotknąć, ale zanim stwardnieje, wlej agar TGHL do płytek hodowlanych o średnicy 92 mm, tak aby były wypełnione w 1/4 do 1/3, w komorze bezpieczeństwa biologicznego klasy II.
- Gdy agar zastygnie i całkowicie ostygnie, zaszczepij każdą płytkę 0,5 ml Bd z płynnego bulionu i równomiernie rozprowadz. Pozostaw mieszaninę bulionu Bd do wyschnięcia na talerzu przez około 1 godzinę, a następnie uszczelnij talerze plastikową folią parafinową. Inkubować płytki stroną agarową do dołu w temperaturze 23 °C przez 5 - 7 dni.
- Płytki zalewowe do roztworu do inokulacji zoospor
- Sprawdzaj ruchliwość zoospor pod mikroskopem odwróconego światła, aby zapewnić żywotność codziennie przed inokulacją. Gdy uwalnianie zoospor jest wysokie, a wiele zoospor pływa poza zarodniami, kultura jest gotowa do zaszczepienia.
- Zalej każdą płytkę 3 ml dojrzałej wody z kranu lub sztucznej wody ze stawu, wlewając wodę do płytki i inkubując w temperaturze pokojowej przez 10 minut, aby umożliwić uwolnienie zoospor do wody. Po okresie inkubacji zdekantować zawiesinę zoospor do nowego sterylnego pojemnika.
- Oszacować stężenie zoospor zgodnie z instrukcjami producenta za pomocą hemocytometru. Gdy znane jest stężenie zawiesiny zoospor, rozcieńczyć zawiesinę do stężenia 1 x 106 zoospor na 3 ml starą wodą z kranu.
- Szczepienie zwierząt
- Zaszczepić każde zwierzę, wylewając 3 ml mieszaniny inokulum na jego pojemnik w indywidualnych pojemnikach o pojemności 50 ml. Pozwolić, aby nadmiar inokulum zebrał się na dnie pojemnika do zaszczepiania. Pozostawić każde zwierzę w indywidualnym pojemniku do zaszczepiania na 24 godziny, aby zapewnić zakażenie, a po 24 godzinach inokulacji zwrócić każdą osobę do zdezynfekowanego terrarium.
- Zdezynfekuj terraria za pomocą dostępnego w handlu roztworu wybielacza o stężeniu 13% objętości/objętości (v/v), spłucz co najmniej dwa razy wodą, a następnie pozostaw do wyschnięcia na nie mniej niż 24 godziny.
- W przypadku kontroli ujemnych Bd, zaszczepić zwierzęta metodą próbną przy użyciu tych samych metod, co w ppkt 3,2 - 3,3, ale zalać płytki agarowe wolne od Bd 5 ml dojrzałej wody z kranu zamiast płytek agarowych zaszczepionych Bd.
4. Test kaspazy 3/7
- Zbieraj czubki palców u nóg od każdego zwierzęcia (zarówno narażonego na Bd, jak i Bd-ujemnego) raz w tygodniu przez 3 tydzień po inokulacji i co dwa tygodnie do końca eksperymentu, do 8 palców u nogi na osobę.
- Odciąć czubek palca u nogi w drugim paliczku za pomocą wysterylizowanych płomieniowo nożyczek, umieścić w mikroprobówce o pojemności 1,5 ml i natychmiast zamrozić w temperaturze -80 °C.
- Ekstrahować białka z zamrożonej próbki palca u nogi.
- Umieścić próbki w 100 μl buforu do próbek (25 mM HEPES pH 7, 5 mM MgCl2) z dwoma kulkami ze stali nierdzewnej (3,2 mm) w mikroprobówce z nakrętką o pojemności 1,5 ml. Próbki należy poddać lizie w 4 cyklach po 1 minutę ubijania kulek z maksymalną prędkością (w tym samym ubijaku do kulek, co w kroku 1.2.1), a następnie 3 minuty na lodzie. Po lizie odwirować próbki w temperaturze 12 000 x g i temperaturze 4 °C przez 5 minut. Zebrać supernatant do użycia w teście.
- Określić ilościowo stężenie białka w próbce za pomocą testu Bradforda.
- Na 384-dołkowej płytce wymieszaj 10 μl ekstraktu białkowego z 10 μl odczynnika Bradford i inkubuj przez 2 minuty w temperaturze pokojowej. Każdą próbkę należy wykonać w dwóch egzemplarzach, wraz z serią 5-krotnych wzorców rozcieńczenia BSA. Odczytać absorbancję przy 595 nm na płytce czytnika absorbancji.
- Alternatywnie, jeśli próbki czubków palców u nóg są zbyt małe (stężenie białka jest bliskie najniższej normy określonej w teście Bradforda lub jeśli żaby, z których pobiera się próbki, mają mniej niż 3 g całkowitej masy), należy ustandaryzować próbki, szacując powierzchnię skóry za pomocą zdjęć, a nie testu Bradforda.
- Przed ekstrakcją białek z próbki do testu kaspazy należy sfotografować każdy palec u nogi w 40-krotnym powiększeniu za pomocą mikroskopu światła odwróconego.
- Przeanalizuj próbkę palca u nogi za pomocą oprogramowania do obrazowania komputerowego, szacując obszar palca. W tym celu narysuj linię wokół krawędzi zacisku na palce i poproś oprogramowanie do obrazowania o oszacowanie obszaru w kształcie. Następnie pomnóż ten obszar przez liczbę pi (3.14), co w przybliżeniu przybliży powierzchnię trójwymiarowej próbki skóry (ponieważ długość x pole przekroju poprzecznego (pi x średnica) daje zewnętrzną powierzchnię probówki).
- Wykonaj test kaspazy 3/7.
- Do 384-dołkowej płytki luminescencyjnej dodaj 10 μl dostępnego w handlu odczynnika kaspazy 3/7 i 10 μl ekstraktu białkowego. Zbadaj każdą próbkę w trzech egzemplarzach.
- Wymieszać odczynniki, potrząsając powoli płytką przez 15 s. Inkubować płytkę z dala od światła przez 30 minut w temperaturze pokojowej. Zmierz luminescencję za pomocą czytnika płytek luminescencyjnych.
