Test kaspazy-3/7: Test oparty na luminescencji do ilościowego określania apoptozy poprzez pomiar aktywności kaspazy-3/7 w eksplantatach skóry żaby

Streszczenie

Źródło: Brannelly, L. A. et al., Using Terminal Transferase-mediated dUTP Nick End-labelling (TUNEL) and Caspase 3/7 Astest to Measure Epidermal Cell Death u Frogs with Chytridiomycosis. J. Vis. Exp. (2018).

Ten film opisuje test luminescencyjny in vitro kaspazy-3/7 do ilościowego określenia śmierci komórki lub apoptozy. Test mierzy luminescencję wytwarzaną po rozszczepieniu kaspazy-3/7 proluminescencyjnego substratu DEVD. Generowana luminescencja jest proporcjonalna do aktywności kaspazy-3/7.

Protokół

Wszystkie procedury związane z modelami zwierzęcymi zostały sprawdzone przez lokalny komitet ds. opieki nad zwierzętami oraz komisję weterynaryjną JoVE.

1. Hodowla i monitorowanie zwierząt

1. Zwierzęta trzymane w domu indywidualnie, w środowisku odpowiednim dla gatunku, z odpowiednim harmonogramem nawadniania, karmienia i czyszczenia. Codziennie sprawdzaj zwierzęta.
   1. Wykorzystać dorosłe osobniki zagrożonej Litoria verreauxii alpina (do testu kaspazy 3/7, sekcja 4), pochodzące z obiektów hodowlanych w niewoli. Utrzymuj zwierzęta w temperaturze 15 - 18 °C, na podłożu z mchu i żwir....

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
POLARstar Omega	BMG Labtech		Czytnik płytek luminescencyjnych
384-dołkowa płaska, przezroczysta płyta dolna	Corning	3707
384-studniowa niska płyta dolna z białym płaskim kołnierzem	Corning	Numer katalogowy: 3570
Agar bakteriologiczny (Oxoid)	rybak	OXLP0011B
Rosół laktozowy (Oxoid)	rybak	OXCM0137B
Wodorowęglan sodu	rybak	Zobacz materiał BP328-500
Trican-S (MS-222)	rybak	NC0872873
Trypton	rybak	Zobacz materiał BP1421-500
Albumina surowicy bydlęcej	Invitrogen	15561020
Sterylny wacik ze sztucznego jedwabiu	Drut i sprzęt medyczny	Okręt MW-113
Odczynnik Coomassie Bradford	przebijać	23200
Kaspaza Glo 3/7	Preparat Promega	Kontroler G8090
Bufor HEPES	Sigma-Aldrich	H0887-20ML
Chlorek magnezu	Sigma-Aldrich	Numer katalogowy: 1374248-1G
Hydrolizat żelatyny Enzymatyczny	Sigma-Aldrich	G0262
PBS (sól fizjologiczna buforowana fosforanami), pH 7,2 (1X)	Temperatura/Życie	20-012-043
Prepman (Przedczłowiek)	Temperatura/Życie	4318930
TaqMan Szybki Zaawansowany Master Mix	Rybak termiczny	4444556
Wybielacz Clorox	Clorox
Etanol, 200 proof, klasa molekularna	rybak	BP2818500
Mikroskop fluorescencyjny ZEISS Axio Scan	Carl Zeiss		Mikroskop fluorescencyjny
Koraliki ze stali nierdzewnej 3,2 mm	Specyfikacja biologiczna	11079132SS
Podkład ITSI-3 Chytr (5′-CCTTGAT ATAATACAGTGTGCCATATGTC-3′)	Taqman powiedział:		Indywidualny projekt podkładów i sondy
Podkład 5.8S Chytr (5′-TCGGTT CTCTAGGCAACAGTTT-3′)	Taqman powiedział:		Indywidualny projekt podkładów i sondy
Sonda do spoiwa z mniejszymi rowkami Chytr MGB2(5′-CGAGTCGAAC-3′)	Taqman powiedział:		Indywidualny projekt podkładów i sondy
Instrumenty qPCR Rotor-Gene	Qiagen powiedział:		Maszyna do qPCR
Probówki do mikrowirówek 1,5 ml	rybak	Numer katalogowy: 02-681-372
Płytki Petriego do hodowli komórkowych	Nunc	263991
Mini-beadBeater Koraliki cyrkorowo-silikatowe, 0.5mm	Specyfikacja biologiczna	11079105Z

TGL TGL powiedział: powiedział: