Test fagocytozy: technika barwienia immunologicznego do wizualizacji pochłaniania komórek apoptotycznych w komórkach embrionalnych Drosophila melanogaster

Streszczenie

Źródło: Nonaka, S. et al. Test fagocytozy dla komórek apoptotycznych w zarodkach Drosophila. J. Vis. Exp. (2017).

Ten film demonstruje technikę barwienia immunologicznego, aby uwidocznić pochłanianie komórek apoptotycznych w homogenizowanych komórkach embrionalnych Drosophila melanogaster. Metoda ta zapewnia wgląd w fizjologię komórkową poprzez określenie zakresu apoptotycznego pochłaniania komórek.

Protokół

Wszystkie procedury dotyczące modeli zwierzęcych zostały sprawdzone przez lokalny instytucjonalny komitet opieki nad zwierzętami oraz weterynaryjną komisję rewizyjną JoVE.

1. Barwienie hemocytów

1. Barwienie immunologiczne przeciwciałem anty-Croquemort
   1. Szkiełka należy stopniowo moczyć w metanolu przez 10 min, w PBS zawierającym 0,2% (v/v) Triton X-100 przez 10 min, a następnie w PBS przez 10 min.
   2. Umieścić 20 μl 5% (v/v) surowicy całej świni w PBS zawierającym 0,2% (v/v) Triton X-100 na komórkach w celu zablokowania. Inkubować szkiełka w temperaturze pokojowej przez 20 minut.
   3. Usunąć roztwór ze szkiełek podstawowych i umieścić na komórkach 20 μl surowicy anty-Croquemort (0,1% (v/v)) w PBS zawierającym 0,2% (v/v) Triton X-100. Szkiełka inkubować w temperaturze 4 °C przez noc.
   4. Namocz szkiełka podstawowe w PBS zawierającym 0,2% (v/v) Triton X-100 przez 10 minut 5 razy.
   5. Namocz szkiełka podstawowe w PBS przez 10 minut.
   6. Umieścić 20 μl alkalicznej anty-szczurzej IgG znakowanej fosfatazą alkaliczną (0,5% (v/v)) w PBS zawierającym 0,2% (v/v) Triton X-100 i 5% (v/v) surowicy całej świni na komórkach w temperaturze pokojowej przez 1 godzinę.
   7. Namocz szkiełka podstawowe w PBS zawierającym 0,2% (v/v) Triton X-100 przez 10 minut 5 razy.
   8. Namocz szkiełka w buforze zawierającym 100 mM Tris-HCl, pH 9,5, 100 mM NaCl i 50 mM MgCl2 przez 10 minut.
   9. Zamontuj na komórkach roztwór substratu fosfatazy zawierający 0,23 mg/ml 5-bromo-4-chloro-3-indolilofosforanu (BCIP), 0,35 mg/ml nitro niebieskiego tetrazolu (NBT), 100 mM Tris-HCl, pH 9,5, 100 mM NaCl i 50 mM MgCl₂
   .
   10. Obserwuj komórki pod mikroskopem pod kątem prawidłowego barwienia. Gdy w granulkach hemocytów pojawią się silne fioletowe sygnały, usuń roztwór substratu i zanurz szkiełka w buforze składającym się z 10 mM Tris-HCl, pH 8,5 i 1 mM EDTA. Zaleca się barwienie przez około 5 - 10 minut.

2. Barwienie komórek apoptotycznych przez TUNEL

1. Namocz szkiełka podstawowe w PBS przez 5 minut.
2. Powtórz tę czynność z nowym PBS.
3. Zamontuj bufor równowagi (patrz tabela materiałów) na komórkach na 10 minut.
4. Wyjąć roztwór ze szkiełek podstawowych i umieścić 20 μl roztworu TdT zawierającego 5 μl końcowej deoksynukleotydylotransferazy i 15 μl buforu reakcyjnego na komórkach w temperaturze 37 °C na 1 godzinę.
5. Usunąć roztwór ze szkiełek podstawowych i namoczyć szkiełka w buforze składającym się z 0,5 ml buforu STOP/Wash i 17 ml wody.
6. Namocz szkiełka w PBS przez 5 minut 3 razy.
7. Zamontuj 20 μl peroksydazy anty-digoxigeniny na komórkach w temperaturze pokojowej przez 30 minut.
8. Namocz szkiełka szklane w PBS przez 5 minut 4 razy.
9. Szkiełka podstawowe namoczyć w roztworze substratu peroksydazy składającym się z 30 ml 50 mM Tris-HCl o pH 7,5 zawierającym pełną mikroszpatułkę tetrahydrichlorku 3,3'-diaminobenzydyny (DAB) i 0,002% (v/v)_H2O2 przez 30 s.
10. Powtarzaj powyższy krok, aż komórki apoptozy zostaną zabarwione na brązowo. Namocz szkiełka szklane w wodzie, aby zatrzymać reakcję peroksydazy.
11. Umieść komórki w wodzie do obserwacji.

3. Zmierz poziom fagocytozy komórek apoptotycznych

1. Obserwuj próbki pod mikroskopem świetlnym w celu oceny poziomu fagocytozy. Policz komórki Croquemort-dodatnie lub komórki GFP-dodatnie jako hemocyty, komórki TUNEL-dodatnie jako komórki apoptotyczne i komórki podwójnie dodatnie jako hemocyty fagocytozujące.
2. Indeks fagocytarny definiuje się jako liczbę komórek podwójnie dodatnich w stosunku do całkowitej liczby komórek Croquemort-dodatnich lub komórek GFP-dodatnich. Zaleca się obserwację ponad 300 hemocytów.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
surowica całej świni	MP Biomedycyna	Numer katalogowy: 55993	Do blokowania
Kpl Anti-Rat IgG (H+L) Ab MSA, AP	KPL (Polskie Biuro	tel. 475-1612	przeciwciało drugorzędowe dla hemocytów barwiących z przeciwciałem anty-Croquemort
5-bromo-4-chloro-3-indolilofosforan	Roche	11383221001	BCIP, Do barwienia hemocytów
Nitro niebieski tetrazolium	Roche	11383213001	NBT, Do barwienia hemocytów
Przeciwciało anty-Croquemort			opisane wcześniej w Manaka et al, J. Biol. Chem., 279, 48466-48476
Zestaw do wykrywania apoptozy peroksydazy in situ Apop Tag	Milipory	Zobacz materiał S7100	Do barwienia komórek apoptoitcznych. Ten zestaw zawiera bufor równoważący, bufor reakcyjny, bufor STOP/Wash, enzym TdT i peroksydazę anty-digoxigenin-peroksydazę.
Tetrahydrichlorek 3,3'-diaminobenzydyny	Nacalai Teskajska	Rozdział 11009-41	DAB, Do barwienia komórek apoptoitycznych

Prasowe