$$\rightleftharpoonup{xx}$$
$$\longleftharp{xx}$$,
$$\longrightharp{xx}$$,
Wszystkie procedury z udziałem ludzi zostały przeprowadzone zgodnie z instytucjonalnymi, krajowymi i międzynarodowymi wytycznymi dotyczącymi dobrobytu ludzi i zostały sprawdzone przez lokalną komisję rewizyjną instytucji.
1. Hodowla i przygotowanie linii komórkowej monocytów THP-1
- Hodowla monocytów THP-1 w postaci kultury zawiesinowej w kolbach T25 w temperaturze 37 °C + 5% CO2 . Komórki należy hodować w 5 ml Roswell Park Memorial Institute 1640 (RPMI 1640) + 10% płodowej surowicy bydlęcej (FBS).
- Każdego dnia należy zawiesić komórki równomiernie w pożywce wzrostowej, delikatnie potrząsając kolbą, a następnie natychmiast policzyć komórki za pomocą hemocytometru. Komórki powinny być pasażowane, gdy gęstość komórek osiągnie 1 x 106 komórek/ml:
- Wstępnie podgrzany RPMI 1640 + 10% FBS w łaźni wodnej o temperaturze 37 °C.
- Przenieść 2 x 105 komórek do probówki mikrowirówkowej o pojemności 1,5 ml lub stożkowej probówki o pojemności 15 ml i granulować komórki, wirując przy 500 x g w temperaturze pokojowej przez 5 minut.
- Usunąć supernatant bez naruszania osadu komórkowego i ponownie zawiesić osad w 1 ml (1,5 ml probówki mikrowirówkowej) lub 5 ml (15 ml probówka stożkowa) soli fizjologicznej buforowanej fosforanami (PBS).
- Odwirować probówkę o sile 500 x g w temperaturze pokojowej przez 5 minut. Usunąć PBS bez naruszania osadu komórkowego.
- Zawiesić granulat w 1 ml świeżego RPMI 1640 + 10% FBS.
- Do nowej kolby T25 umieścić 4 ml podgrzanej pożywki i dodać do niej ponownie zawieszone komórki z 1.2.5. Hodowla w inkubatorze o temperaturze 37 °C + 5% CO2 do momentu, gdy komórki będą wymagały pasażowania (zwykle 3 dni) lub do momentu, gdy komórki będą potrzebne do eksperymentu.
- W przypadku eksperymentu z makrofagami pochodzącymi z THP-1, przed pasażowaniem należy usunąć wymaganą liczbę komórek z kolby i płytki:
- Umieść wymaganą liczbę okrągłych szkiełek nakrywkowych o średnicy 18 mm (grubość #1.5) w dołkach 12-dołkowej płytki - zwykle 1 szkiełko nakrywkowe na warunek i/lub punkt czasowy. Do każdej studzienki podwielokrotność 5 x 104 monocyty THP-1. W razie potrzeby można zmienić liczbę komórek dodawanych do każdej studzienki.
- Zwiększyć całkowitą objętość każdej studzienki zawierającej komórkę do 1 ml za pomocą RPMI + 10% FBS ogrzanego do 37 °C.
- Dodaj 100 nM 12-mirystynianu 13-octanu forbolu (PMA) do każdej studzienki i hoduj przez 3 dni, aby wywołać różnicowanie monocytów THP-1 w komórki podobne do makrofagów.
2. Hodowla i przygotowanie linii komórkowej makrofagów J774.2
- Hodowla komórek J774.2 w kolbach T25 w temperaturze 37 °C + 5% CO2 . Komórki należy hodować w 5 ml zmodyfikowanego podłoża Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) + 10% FBS i pasażować, gdy hodowla osiągnie 80-90% zbieżności. Aby przejść komórki:
- Wyjąć wszystkie podłoża z kolby i jednokrotnie wyrośnąć z 5 ml PBS.
- Usunąć PBS z kolby i zastąpić 5 ml świeżego DMEM + 10% FBS.
- Za pomocą skrobaka do komórek zeskrobać dno kolby, aby zawiesić komórki w pożywce. Energicznie odpipetuj komórki kilka razy, aby rozbić wszelkie agregaty komórek.
- Rozcieńczyć komórki w stosunku 1:5, usuwając 4 ml zawiesiny komórek z kolby i zastępując ją 4 ml świeżej pożywki. Pozostałą zawiesinę komórkową można wyrzucić, użyć do rozpoczęcia nowej hodowli komórkowej w świeżej kolbie T25 lub użyć do eksperymentu.
- Aby przygotować się do testu efferocytozy przy użyciu komórek J774.2:
- Na dzień przed rozpoczęciem eksperymentu zawiesić komórki J774.2 w 5 ml świeżej pożywki, zgodnie z krokami 1.1.1–1.1.3. Policz komórki za pomocą hemocytometru i przygotuj niezbędną objętość komórek o stężeniu 5 x 104 komórek/ml.
- Umieść niezbędną liczbę okrągłych szkiełek nakrywkowych o średnicy 18 mm (grubość #1.5) w dołkach 12-dołkowej płytki. Do każdej studzienki podamy 1 ml zawiesiny komórkowej 5 x 104 komórek/ml.
- Hodowla przez noc, aby komórki mogły przylgnąć do szkiełka nakrywkowego i odzyskać siły po pasażowaniu.
3. Hodowla pierwotnych ludzkich makrofagów M2
- Zbierz 10 ml heparynizowanej krwi ludzkiej na każdą wymaganą 12-dołkową płytkę makrofagów M2.
- W probówce wirówkowej o pojemności 15 ml ułóż 5 ml ludzkiej krwi na 5 ml wstępnie podgrzanego podłoża do separacji limfolitów i polikomórek. Przygotuj wiele probówek, jeśli przetwarzasz >5 ml krwi, zamiast używać probówek o większej objętości.
- Wirować przy 300 x g przez 35 minut, używając średniego przyspieszenia i bez przerwy.
- Ostrożnie usunąć górną prążek bogatą w komórki jednojądrowe za pomocą plastikowego pipetora i przenieść do probówki wirówkowej o pojemności 50 ml. Jeśli w kroku 3.2 przygotowano wiele probówek, pasma można połączyć w jedną probówkę o pojemności 50 ml. Doprowadzić objętość probówki do 50 ml za pomocą PBS.
- Wirować przy 300 x g przez 8 minut i usunąć supernatant. Podczas tego etapu umieść autoklawowane okrągłe szkiełka nakrywkowe o średnicy 18 mm (grubość #1,5) w każdym dołku 12-dołkowej płytki.
- Zawiesić osad komórkowy w 300 μl RPMI 1640 bez surowicy na żądaną liczbę dołków; Na przykład, jeśli przetworzono 10 ml krwi w celu przygotowania pełnej 12-dołkowej płytki, zawiesić osad komórkowy w 3,6 ml pożywki.
- Dodać 300 μl zawiesiny komórkowej do każdego dołka zawierającego szkiełko nakrywkowe na płytce 12-dołkowej. Inkubować przez 1 godzinę w temperaturze 37 °C + 5% CO2 .
- Delikatnie umyj szkiełko nakrywkowe 3x 1 ml podgrzanego PBS, aby usunąć wszelkie nieprzylegające komórki.
- Dodaj 1 ml RPMI 1640 + 10% FBS + 10 ng/ml rekombinowanego ludzkiego M-CSF + antybiotyk/środek przeciwgrzybiczy do hodowli komórkowych. Inkubować w temperaturze 37 °C + 5% CO2 przez 5 dni.
- Zastąp pożywkę RPMI 1640 + 10% FBS + 10 ng / ml rekombinowany ludzki M-CSF + 10 ng / ml rekombinowany ludzki IL-4 + antybiotyk / antybiotyk / antybiotyk do hodowli komórkowych. Inkubować w temperaturze 37 °C + 5% CO2 przez 2 dni, aby zakończyć polaryzację M2.
- Spolaryzowane makrofagi należy zużyć w ciągu najbliższych 3 dni.
4. Przygotowanie apoptotycznych komórek Jurkat
- Hodowla komórek Jurkata w 5 ml RPMI 1640 + 10% FBS w temperaturze 37 °C + 5% CO2 . Jurkats są zawiesinową linią komórkową i mogą być utrzymywane przez pasażowanie 1:5 do świeżej, wstępnie podgrzanej pożywki co 3-5 dni.
- Aby przygotować komórki apoptotyczne, pozwól kulturze Jurkat urosnąć do dużej gęstości (4-5 dni po pasażowaniu). Porcję 1,5 ml do probówki mikrowirówkowej o pojemności 1,5 ml i komórek osadu przez odwirowanie przy 500 x g przez 5 min.
- Odrzucić supernatant i ponownie zawiesić osad komórkowy w 1 ml bezsurowicowego podłoża RPMI 1640 zawierającego 1 μM staurosporynę.
- Inkubować przez 16 godzin w temperaturze 37 °C + 5% CO2 w celu uczynienia komórek apoptotycznymi.
- W razie potrzeby potwierdź indukcję apoptozy przez barwienie Aneksyną V:
- Podwielokrotność 100 μl hodowli komórek Jurkat poddanych działaniu staurosporyny do 1,5 ml probówki do mikrowirówki. Komórki osadu należy rozdmuchiwać przez odwirowanie przy 500 x g przez 5 minut, odrzucić supernatant i ponownie zawiesić osad komórkowy w 100 μl pożywki RPMI 1640 bez surowicy.
- Dodać 1 μl aneksyny V sprzężonej z izotiocyjanianem fluoresceiny (FITC) i inkubować przez 10 minut w temperaturze pokojowej w ciemności.
- Dodać 900 μl PBS i przenieść całą objętość do pojedynczego dołka 12-dołkowej płytki zawierającej okrągłe szklane szkiełko nakrywkowe o średnicy 18 mm (grubość #1,5). Wirować w wirówce wyposażonej w adapter płytkowy o gramaturze 200 x g przez 1 minutę, aby zmusić komórki do przylegania do szkiełka nakrywkowego. Alternatywnie, komórki można umieścić w komorze w celu obrazowania.
- Obraz za pomocą mikroskopu fluorescencyjnego.
5. Kwantyfikacja wychwytu i dynamiki efferocytów za pomocą testu eladecytozy z komórek stałych i barwienia na lewą stronę
- Przygotować ludzkie makrofagi THP-1, J774.2 lub M2 zgodnie z opisem odpowiednio w sekcjach 1-3.
- Wieczorem przed rozpoczęciem eksperymentu przygotuj apoptotyczne komórki Jurkata zgodnie z opisem w sekcji 4.
- Bezpośrednio przed eksperymentem policz komórki apoptotyczne za pomocą hemocytometru. Przenieś wystarczającą liczbę komórek apoptotycznych do probówki mikrowirówkowej o pojemności 1,5 ml – zwykle dodajemy 5 x 105 komórek / dołek, zapewniając stosunek celu do efferocytów 10: 1.
- Komórki Jurkata osadzać przez odwirowanie przy 500 x g przez 5 minut i ponownie zawiesić w 500 μl PBS.
- Podczas wirowania przelej 10 μl DMSO do nowej probówki mikrowirówkowej o pojemności 1,5 ml. Rozpuścić w DMSO minimalną ilość N-hydroksysukcynimidobiotyny (NHS-Biotyna). Wystarczy 5-10 kryształów (~0,005 mg).
- Przenieść 500 μl komórki apoptotycznej/zawiesiny PBS do probówki zawierającej DMSO/NHS-biotynę. Następnie rozcieńczyć barwnik śledzący komórki do stężenia zalecanego przez producenta w apoptotycznej zawiesinie komórek. Upewnij się, że wybierasz barwnik śledzący komórki, który nie nakłada się spektralnie na FITC-Streptawidynę (np. czerwony lub daleki czerwony barwnik śledzący komórki).
- Inkubować zawiesinę przez 20 minut w temperaturze pokojowej w ciemności. Dodaj równą objętość RPMI 1640 + 10% FBS i inkubuj przez 5 minut w temperaturze pokojowej w ciemności, aby ugasić nieprzereagowany barwnik.
- Osadzać komórki przez odwirowanie przy 500 x g przez 5 minut, odrzucić supernatant i ponownie zawiesić wybarwione komórki apoptotyczne w 100 μl RPMI 1640 + 10% FBS na studzienkę makrofagów.
- Dodaj kroplami 100 μl barwionej zawiesiny komórek apoptotycznych do każdej studzienki makrofagów. Wirować 200 x g przez 1 minutę w wirówce wyposażonej w adapter płytki do wymuszenia kontaktu między makrofagami a komórkami apoptozą.
- Inkubować płytkę przez żądany okres czasu w temperaturze 37 °C + 5% CO2 w inkubatorze do hodowli tkankowych. W przypadku makrofagów materiał zefferocytozowany jest zwykle po raz pierwszy wykrywalny po 20–30 minutach, a kończy się po 120–180 minutach.
- W żądanym punkcie czasowym należy usunąć komórki z inkubatora. Umyj komórki dwukrotnie 1 ml PBS o temperaturze pokojowej, aby zatrzymać efferocytozę i usunąć niezefferocytozowane komórki apoptotyczne.
- Dodać streptawidynę sprzężoną z FITC w rozcieńczeniu 1:1 000 do każdego dołka i inkubować przez 20 minut w ciemności. Spowoduje to oznaczenie odsłoniętej biotyny na dowolnym niezniewieściałym materiale komórek apoptozy.
nuta: W razie potrzeby jądra komórkowe można wybarwić na tym etapie przez dodanie rozcieńczenia Hoechst 33342 lub dichlorowodorku 4',6-dimidino-2-fenyloindolu (DAPI) w stosunku 1:20 000.
- Umyj komórki 3 razy 1 ml PBS, delikatnie potrząsając lub kołysząc próbki przez 5 minut na płukanie. Utrwal komórki za pomocą 4% paraformaldehydu (PFA) w PBS przez 20 minut w temperaturze pokojowej. Przepłucz komórki raz PBS, aby usunąć nadmiar PFA.
- Zamontuj szkiełka nakrywkowe na szkiełku podstawowym w celu obrazowania i przeniesienia do mikroskopu fluorescencyjnego. Przechwyć stosy z wystarczającą liczbą komórek w celu dokładnej oceny ilościowej — zwykle 10–30 komórek na warunek. Niezinternalizowany apoptotyczny materiał komórkowy będzie widoczny na wynikowym obrazie jako materiał znakowany barwnikiem śledzącym komórki, otoczony barwieniem FITC-streptawidyną, podczas gdy materiał zefferocytozowany tworzy dyskretny barwnik śledzący komórki, wolny od barwienia streptawidyną.
- Określ ilościowo efferocytozę na uzyskanych obrazach za pomocą różnych pomiarów:
- Oblicz indeks efferocytarny, określając średnią liczbę dyskretnych efferosomów (barwnik śledzący komórkę + / streptawidyna - puncta) na makrofaga. Określ ilościowo tylko makrofagi związane z komórką apoptotyczną lub zawierające ≥1 widocznych efferosomów. Rejestruj makrofagi związane z komórką apoptozą, ale pozbawione dyskretnych efferosomów, jako mające indeks efferocytarny równy 0.
- Oblicz wydajność efferocytarną, mierząc frakcję makrofagów zawierających ≥1 efferosom.
- Oblicz szybkość efferocytozy, obrazując komórki utrwalone i wybarwione w wielu punktach czasowych. Obrazuj tylko makrofagi związane z komórkami apoptozy lub zawierające widoczne efferosomy, z uchwyconymi stosami z każdej komórki. Po zobrazowaniu określ szybkość efferocytozy:
- Korzystając z barwienia streptawidyną jako przewodnika i narzędzia do zaznaczania odręcznego lub wielokątnego w FIJI/ImageJ (lub innym pakiecie oprogramowania do analizy obrazu), zakreśl cały materiał barwnika śledzącego komórki +/streptawidyny (np. zinternalizowanej) w jednej płaszczyźnie stosu z. Zmierz zintegrowaną intensywność barwnika śledzącego komórki w tym regionie. Indywidualne pomiary dla każdego efferosomu (np. średnica, położenie względem granicy komórki lub jądra itp.) można łatwo uzyskać jednocześnie z tymi pomiarami, co znacznie zwiększa ilość danych zbieranych podczas analizy.
- Na tym samym przekroju Z, używając barwienia streptawidyną jako przewodnika i narzędzia do zaznaczania odręcznego lub wielokątnego, zakreśl cały materiał barwnika śledzącego komórki + / streptawidyny + (np. niezinternalizowanego) w jednej płaszczyźnie stosu z. Obejmują tylko barwienie z komórek apoptotycznych mających kontakt z fagocytami. Zmierz zintegrowaną intensywność tego regionu.
- Powtórz kroki od 4.2.3.1 do 4.2.3.2 dla pozostałych przekrojów z obrazu. Zsumować łączną intensywność materiałów zefferocytozowanych (Σeff) i nieeferocytozowanych (Σne). Frakcję komórki apoptotycznej, która została poddana efferocytozowi, można obliczyć dla komórki jako:
- Określ ilościowo frakcję znieefferocytozowaną dla wszystkich komórek we wszystkich punktach czasowych. Należy zauważyć, że intensywność fluorescencji komórek apoptotycznych/efferosomów może się różnić między obrazami ze względu na różnice w wychwytywaniu barwników śledzących komórki przez poszczególne komórki apoptotyczne oraz ze względu na zmiany parametrów akwizycji obrazu, takich jak czas ekspozycji. W związku z tym porównuj tylko wartości znormalizowane, takie jak frakcja efferocytozy, lub wartości niezależne od intensywności, takie jak indeks efferocytarny i skuteczność efferocytarna, między obrazami, między warunkami eksperymentalnymi i między powtórzonymi eksperymentami.
- Aby upewnić się, że wynikowy zestaw danych dokładnie odzwierciedla różnice w eferocytozie między komórkami, należy przeprowadzić te analizy na maksymalnej możliwej liczbie komórek w każdym eksperymencie.
nuta: Skuteczność efferocytarną i indeks efferocytarny można szybko obliczyć (kilka sekund na komórkę) i zazwyczaj staramy się przeanalizować co najmniej 100 komórek na eksperyment, powtarzając każdy eksperyment co najmniej 3 razy. Obliczanie frakcji materiału efferocytozowanego i pomiary specyficzne dla efferosomów są bardziej pracochłonne, zwykle zajmują doświadczonemu analitykowi 2-3 minuty na komórkę. W tych obliczeniach określamy ilościowo co najmniej 15 komórek na warunek na eksperyment.
- Zapisuj indeks efferocytarny, frakcję efferocytozy i dane dotyczące poszczególnych efferosomów w przeliczeniu na komórkę.
nuta: Pozwala to na analizę danych przy użyciu podejść jednokomórkowych, co pozwala na ilościowe określenie zmian między komórkami. Analizy na poziomie populacji można nadal przeprowadzać na tych zestawach danych, uśredniając dane z pojedynczych komórek uzyskane w poszczególnych eksperymentach. Pomiary specyficzne dla efferosomów mogą być analizowane na poziomie populacji, na poziomie pojedynczej komórki oraz jako zespoły (np. jako populacje efferosomów niezależne od komórek, które je zawierają).