Wszystkie procedury związane z modelami zwierzęcymi zostały sprawdzone przez lokalny komitet ds. opieki nad zwierzętami oraz komisję weterynaryjną JoVE.
1. Przygotowanie mediów
- Dodać wszystkie składniki, jak opisano w Tabeli 1, aby uzyskać podstawową pożywkę do pobierania oocytów i pożywkę do dojrzewania oocytów. W przypadku podstawowego podłoża zbiorczego należy ustawić pH na 7,4. Zarówno w przypadku pobierania, jak i pożywki do dojrzewania, w dniu stosowania dodać 3 mg/ml albuminy surowicy bydlęcej (BSA) i 1 μM cilostamidu.
2. Przygotowanie kodowania mRNA dla Ypet-3' UTR i mCherry
- Uzyskaj sekwencje 3′ UTR interesujących mRNA.
nuta: Na potrzeby tego badania sekwencje uzyskano wcześniej z cDNA oocytów myszy.
- Zaprojektuj startery do amplifikacji docelowych 3' UTR z cDNA oocytu i części wektora pcDNA 3.1 zawierającego sekwencję kodującą Ypet, znacznik epitopu V5 i promotor T7.
- Amplifikacja za pomocą zestawu polimerazy DNA o wysokiej wierności. Uruchom produkty reakcji łańcuchowej polimerazy (PCR) na żelu, aby sprawdzić, czy fragmenty mają odpowiedni rozmiar, wyciąć prążki i wyekstrahować DNA z żelu za pomocą zestawu do ekstrakcji żelu zgodnie z instrukcjami producenta.
- Połącz fragmenty PCR z wektorem za pomocą zestawu do klonowania PCR.
nuta: Fragmenty PCR inkubowano na lodzie przez 4 godziny, aby ułatwić bardziej wydajny proces rekombinacji. Jest to sprzeczne z instrukcjami producenta, które zalecają czas inkubacji wynoszący zaledwie 45 minut.
- Transfekcyjna reakcja PCR przekształca się w kompetentne 5-α bakterie Escherichia coli.
- Dodaj mieszaninę i plazmid do bakterii i inkubuj na lodzie przez 30 minut.
- Mieszaninę i plazmid poddać szokowi termicznemu, umieszczając mieszaninę w łaźni wodnej o temperaturze 42 °C na 45 s i natychmiast schłodzić na lodzie przez 3 minuty.
- Dodać 500 μl bulionu Super Optimal z pożywką do represji katabolicznej (SOC) i inkubować przez 1 godzinę w temperaturze 37 °C.
- Wirować z prędkością 7000 × g przez 2 minuty i usunąć większość supernatantu. Zawiesić i umieścić na płytce agarowej Luria Bulion (LB) z odpowiednim doborem antybiotyku.
nuta: W tym badaniu zastosowano karbenicylinę.
- Inkubować przez noc w temperaturze 37 °C. Wyizolować kolonie, lekko naciskając końcówkę pipety na jedną z kolonii i umieszczając ją w 3 ml pożywki LB ze 100 μg/ml karbenicyliny. Inkubować przez 12-24 godziny w temperaturze 37 °C.
- Wyodrębnij DNA plazmidów za pomocą zestawu do izolacji plazmidowego DNA zgodnie z instrukcjami producenta i potwierdź sekwencje za pomocą sekwencjonowania DNA.
- Dla Ypet/3' UTR:
- Opracowanie liniowej matrycy PCR do transkrypcji in vitro. Użyj startera do przodu przed sekwencją Ypet i startera wstecznego z 20 dodatkowymi pozostałościami tyminy. Patrz Tabela 2 dla sekwencji Ypet/IL-7 3' UTR oraz sekwencji starterów do przodu i do tyłu.
nuta: Te dodatkowe reszty tyminy dodadzą oligo(A) do liniowego mRNA po transkrypcji in vitro.
- Transkrybować produkt PCR in vitro za pomocą zestawu do transkrypcji T7 zgodnie z instrukcjami producenta.
- Oczyść powstały komplementarny RNA (cRNA) za pomocą zestawu do czyszczenia transkrypcji zgodnie z instrukcjami producenta.
- Eluuj oczyszczone cRNA w wodzie wolnej od RNAzy, zmierz stężenie i oceń integralność za pomocą elektroforezy agarozowej. Przechowywać w temperaturze -80 °C.
- Dla mCherry:
- Stwórz liniową matrycę PCR do transkrypcji in vitro przy użyciu enzymu restrykcyjnego o wysokiej wierności; użyj enzymu restrykcyjnego mfEI-HF, jeśli replikujesz ten przykład. Trawić w buforze mineralizacyjnym przez noc w temperaturze 37 °C.
- Uruchom żel, aby oczyścić próbkę i wyekstrahować liniowe DNA za pomocą zestawu do ekstrakcji żelu zgodnie z instrukcjami producenta.
- Transkrybować produkt PCR in vitro za pomocą zestawu do transkrypcji T7 zgodnie z instrukcjami producenta.
- Poliadenylować cRNA (150-200 nukleotydów) za pomocą zestawu do ogonowania poli(A) zgodnie z instrukcjami producenta.
- Oczyść powstałe cRNA za pomocą zestawu do czyszczenia transkrypcji zgodnie z instrukcjami producenta.
- Eluuj oczyszczone cRNA w wodzie wolnej od RNAzy, zmierz stężenia mRNA i oceń integralność wiadomości za pomocą elektroforezy żelowej. Przechowywać w temperaturze -80 °C.
3. Procedura eksperymentalna
UWAGA: Schematyczny przegląd mikroiniekcji oocytów i późniejszej mikroskopii poklatkowej jest podany na rysunku 1.
- Dzień 1
- Dootrzewnowo wstrzyknąć 21-dniowym myszom 5 j.m. gonadotropiny surowicy ciężarnej klaczy, aby pobudzić wzrost pęcherzyków do etapu antralnego.
- Dzień 3
- Pobieranie komórek jajowych
- Ostrożnie otwórz pęcherzyki antralne, wykonując małe nacięcie w ścianie pęcherzyka za pomocą igły 26 G. Wyizoluj nienaruszone oocyty zamknięte w wzgórkach (COC) z kilkoma warstwami komórek wzgórka za pomocą szklanej pipety obsługiwanej przez usta.
- Użyj mniejszej pipety (nieco większej niż średnica oocytu) i mechanicznie usuń COC poprzez wielokrotne pipetowanie.
nuta: Alternatywnie należy wykonać mikroiniekcję na nienaruszone COC.
- Za pomocą większej pipety odessać ogołocone oocyty i umieścić je na szalce Petriego z pożywką do dojrzewania uzupełnioną 1 μM inhibitora fosfodiesterazy, cylostamidu, aby zapobiec wznowieniu dojrzewania mejotycznego. Umieść naczynie w inkubatorze na 2 godziny, aby oocyty mogły dojść do siebie po stresie wywołanym izolacją oocytów od pęcherzyków.
- Mikroiniekcja komórek jajowych
- Przygotować igły do wstrzykiwań, umieszczając rurkę kapilarną ze szkła borokrzemianowego o długości 10 cm w mechanicznym ściągaczu. W celu uzyskania optymalnego wstrzyknięcia, należy zegnąć końcówkę igły pod kątem 45° za pomocą podgrzanego filamentu.
- Przygotuj naczynia styropianowe z 20 μl kropelkami podstawowego podłoża do pobierania oocytów i przykryj kropelki lekkim olejem mineralnym.
- Przygotuj mieszankę reporterową, dodając 12,5 μg/μL Ypet-3' UTR i 12,5 μg/μL mCherry. Przygotować większą objętość i wykonać porcje do przyszłych doświadczeń, aby zapewnić podobne stężenia reporterowe. Przechowywać te podwielokrotności w temperaturze -80 °C. Po rozmrożeniu najpierw odwirować podwielokrotność porcji przez 2 minuty przy 20 000 x g i przenieść do nowej probówki do mikrowirówki.
nuta: To odwirowanie zapobiegnie zatkaniu igły iniekcyjnej przez potencjalne agregaty w mieszance reporterowej.
- Obciążyć igłę iniekcyjną kapilarnie około 0,5 μl mieszanki reporterowej.
- Umieścić pipetę przytrzymującą i załadowaną igłę do wstrzykiwań w uchwytach i umieścić w kropli pożywki do pobierania oocytów. Odessać część pożywki do pipety podtrzymującej.
- Otworzyć igłę do wstrzykiwań, delikatnie stukając nią o pipetę przytrzymującą.
- Umieścić oocyty w kropli zasadowej pożywki zbiorczej i wstrzyknąć 5-10 ml mieszanki reporterowej.
- Inkubować oocyty w pożywce dojrzewającej z 1 μM cilostamidem przez 16 godzin, aby sygnał mCherry ustabilizował się.
- Przygotować szalkę Petriego, która będzie używana do mikroskopii poklatkowej z co najmniej dwiema kroplami pożywki dojrzewającej o objętości 20 μl na każdy wstrzyknięty reporter: jedną kroplę z 1 μM cilostamidem do kontroli oocytów zatrzymanych w profazie I i jedną kroplę bez cylostamidu dla dojrzewających oocytów. Przykryj kropelki lekkim olejem mineralnym i umieść w inkubatorze.
- Mikroskopia poklatkowa
- Po wstępnej inkubacji należy wyjąć wstrzyknięte oocyty z inkubatora i przemyć je czterokrotnie w pożywce do dojrzewania bez cilostamidu. Trzymaj niektóre oocyty w pożywce do dojrzewania z 1 μM cilostamidem jako grupą kontrolną oocytów zatrzymaną w profazie I.
- Przenieś wstrzyknięte oocyty do odpowiednich kropelek na wcześniej przygotowanej czaszy mikroskopu poklatkowego. Zgrupuj oocyty za pomocą zamkniętej szklanej pipety (zamkniętą pipetę można przygotować, trzymając końcówkę w płomieniu przez kilka sekund).
nuta: Grupowanie oocytów pomaga zapobiegać ich ruchowi podczas nagrywania.
- Umieścić szalkę pod mikroskopem wyposażonym w system oświetlenia diodami elektroluminescencyjnymi i zmotoryzowany stolik wyposażony w komorę środowiskową utrzymywaną w temperaturze 37 °C i 5% CO2 . Aby powtórzyć to badanie, użyj następujących parametrów: zestaw filtrów: lustro dichroiczne YFP/CFP/mCherry 69008BS; Kanał YFP (wzbudzenie (Ex): S500/20 × 49057; Emisja (EM): D535/30 m 47281), mKanał Cherry (np.: 580/25 × 49829; Em: 632/60 m).
- Wprowadź odpowiednie ustawienia dla eksperymentu poklatkowego (patrz Spis materiałów dla oprogramowania użytego w tym badaniu): Kliknij Aplikacje | Akwizycja wielowymiarowa. Wybierz pierwszą zakładkę Main i wybierz timelapse, wiele pozycji stage i wiele długości fal.
- Wybierz zakładkę Zapisywanie, aby wprowadzić lokalizację, w której eksperyment ma zostać zapisany.
- Wybierz zakładkę Timelapse, aby wprowadzić liczbę punktów czasowych, czas trwania i przedział czasu.
nuta: Czas trwania eksperymentu poklatkowego zależy od badanego gatunku zwierząt, ponieważ czas dojrzewania mejotycznego oocytów różni się w zależności od gatunku. W tym eksperymencie z oocytami myszy oocyty rejestrowano co 15 minut przez 16 godzin.
- Wybierz zakładkę Etap. Włącz jasne pole i zlokalizuj położenie oocytów, otwierając nowe okno, wybierając Acquire | Nabywanie | Pokaż na żywo. Po zlokalizowaniu oocytów przełącz się z powrotem do okna Akwizycji wielowymiarowej i naciśnij +, aby ustawić lokalizację oocytów.
- Wybierz zakładkę Długości fal i ustaw 3 różne długości fal dla jasnego pola (ekspozycja 15 ms), YFP (ekspozycja 150 ms dla Ypet/IL7 3' UTR) i mCherry (ekspozycja 75 ms dla Ypet/IL7 3' UTR).
nuta: Dostosuj ekspozycję dla każdego reportera Ypet/3' UTR w oparciu o poziom akumulacji reportera i wstrzykniętą objętość. Upewnij się, że sygnał YFP znajduje się w środku zakresu detekcji na początku eksperymentu, aby zapobiec niedoszacowaniu lub nasyceniu w przypadku aktywacji translacji. W przypadku mCherry dostosuj ekspozycję dla każdej partii mCherry, ponieważ sygnał zależy od liczby nukleotydów adeninowych, które zostały dodane podczas procedury poliadenylacji. Ze względu na różnice w skuteczności poliadenylacji, użyj tej samej partii mCherry w różnych eksperymentach, aby uzyskać lepsze porównanie między eksperymentami.
- Rozpocznij eksperyment poklatkowy, klikając przycisk Pobierz. Na rycinie 1 przedstawiono przykład nagrania poklatkowego w pojedynczym oocycie.
- Analiza translacji Ypet-3' UTR
- W celu przeprowadzenia tej analizy (patrz Tabela materiałów dla oprogramowania użytego w tym badaniu) wykonaj dwa pomiary regionu dla każdego oocytu: samego oocytu - kliknij obszar elipsy i otocz oocyt - oraz mały obszar blisko oocytu, który ma być użyty do odejmowania tła - kliknij na obszar prostokątny.
nuta: Upewnij się, że oocyty nie wychodzą poza wybrany obszar podczas nagrywania poklatkowego. Zwróć szczególną uwagę na umiejscowienie obszaru pomiaru wokół wytłoczenia ciała polarnego, ponieważ powoduje to ruch w oocycie i może zniekształcić zapis.
- Wyeksportuj dane pomiarowe regionu do arkusza kalkulacyjnego, klikając najpierw Otwórz dziennik, a następnie Dane dziennika, aby wyeksportować oprogramowanie do analizy danych.
- Dla każdego pojedynczego oocytu i dla wszystkich zmierzonych punktów czasowych odejmij pomiar regionu tła od pomiaru regionu oocytu. Zrób to osobno dla długości fal YFP i mCherry.
Tabela 1: Przygotowanie nośnika. Wykaz składników, które należy dodać do przygotowania podstawowej pożywki do pobierania komórek jajowych i pożywki do dojrzewania komórek jajowych.
| Podstawowa pożywka do pobierania komórek jajowych | |
| składnik | Na 500 ml |
| Zmodyfikowany HEPES Minimum Essential Medium Eagle | 7,1 gr |
| Wodorowęglan sodu | 252 mg tabletki powlekania |
| Pirogronian sodu | 1,15 ml |
| Penicylina/Streptomycyna 100x | 5 ml |
| Ultraczysta woda destylowana (Invitrogen, 10977-015) | Do 500 ml |
| Pożywka do dojrzewania | |
| składnik | Na 500 ml |
| MEM alfa 1x | Do 500 ml |
| Pirogronian sodu | 1,15 ml |
| Penicylina/Streptomycyna 100x | 5 ml |
Tabela 2: Przykład sekwencji reporterowych i starterowych Sekwencja reportera YFP/IL7 3'UTR oraz sekwencje starterów do przodu i do tyłu, które zostały użyte do wytworzenia liniowej matrycy PCR do transkrypcji in vitro.
powiedział:
| kolejność |
| Ypet/Interleukina-7 3' UTR | GAGAACCCACTGCTTACTGGCTTATCGAAATTAATACGACTACTATAGGGAGCAAGCTGGCTAGTTAAGCTGGTGGTACCAGCTCGGATCCACCATCCACCATGGGGGACGGGACCATGGTGAGCAAAGGCGAAGAGCTGTTCACC
GGCGTGGTGCCCATCCTGGTGGAGCTGGACGGCGAACGGACGGACAAGTTCAGAGCGTGGCGGCGGCGGCGGCGAGCGGGGCGGGGGGACCACCACCACCACCACCACCACCGGGG
CCCGTGCCCTGGCCCACCCTGGTGACCACCGGGCTACGGCGTGCAGTGCTTCGCCGTGGTGTGACCGACCACATGAAGCAGCACGACTTCTTCAAGAGCGCCATGCCCGAGGGCTACGTGCAGGAGCGGA
TCTTCTTCAAGGACGACGGCAACTACAAGACCCGGGCCGAGGTGAAGTTCGAGCGACACCCTGGTGAACCATCGAGCTGAAGGGCATCGACTTCAAGGGCATCGACTTCAAGGAGGACGGCAACATCCTGGGACACAAGCTGGAG
TACAACTACAACAGCCACAACGTGTACATCACCGCCGACAAGCAGAGAAGAACGGCATCAAGGCCAACTTCAAGATCCGGCACACACACATCGAGGACGGCGTGCAGCTGGGCCATGGGACCGACCAGACACCAGACCCCA
TCGGCGACGGCCCCGTGCTGCTGCTGCCCCAACCACTACCTGAGCTACCAGAGCGCCCTGTTCAAGGACCAACGAGAAGCGGGAACGAGAAGCGGGACCACATGGTGCTGCTGGAGTTCCTGCCGCCGGCATCACCGGGGGG
ATGAACGAGCTCTATAAGAGATTTCGAAGGTAAGCCTATCCCTAACCCTCCTCTCTCTCTCTCGATTCTCTCTCGCGTCATCACCATCATCACCATCAACAGGACATGTAGTAACAACCTCCAAGAATCTACTGGTT
CATATACTTGGAGAGGGGGAAACCCTTCCAGAAGTTCCTGGATGCCTCCTGCTCAAATAAGCCAAGCAGCTGAGAAATCTACAGTGAGGTATGATGATGGACACAGAAATGCAGCTGCTGCTGCCGTCAGCATATA
CATATAAAGATATATCAACTATACAGATTTTTGTAATGCAATCATGTCAACTGCAATGCTTTTAAAACCGTTCCAAATGTTTCCAAATGTTCCAAATGTTCTACAAAAGCAAAAGGTATGAAGATTCAGAGTCACCACTGTTTTCTT
AGCAAAATGATGGTATGGTTAAACATTGGTGAACCACTGGGGGGGGGGAACTGTCCTGTTTTAGGGAGATACTGGGCTCACGGTGATGATGATGATGATGATGATGATGATGATGATGCTCTTGAAAACAAAGAGTCTCTTAAAGCAGCAG
CAAAAAGAAGCTTAAGGCACTTAAGGCATCAACAAATGTTAAATATGAATGTATAACACATAACTTCAGTAAAGAGCATAGCAGATTTTTTAAATAAAAAAAAAAGTATTTTTAAAAGATAGAAAATGCACTTATTCCAAAGATACTGA
ACCTTAGTATTCAGTCCCTTTTGACACTTGTGTATAATAAAGCTTATATAACTGAATTTTCAATTTGAAAAGTATATTTAAAAGAATAATAATGCTAGACTTTTAATTAATGTATATTATTTAATTTTTTTTTTTTTTTTTGTCTCTCTCTCTCTCTCTCTCTCTCTCTCTCTCTCTCTCTCTCTCTCTCTCTCTCTCTCTCTCTCTCTCTCT
CTGTCTCTCTCTCTCTCTCTCTCTCTCTCTCTCTCTCTCTCTCTCTCTATAATTTTCATATACCAATTGCGTACTTTGGATAGTGTCTCTCTTTTAACCTAAATGACCTTTATTAACCAGGCAGGTTCCCTCTTCTCGAGAG
TGTTCATTGCTGCACTGTCATTTGATCCCAGTTTTATTGAACACATATCCTTTAACACACTCACGTCCAGATTTAGCAGGAGACTAGGACCCTATAACTTTGTTAAGAGAGAAAAAACACTTTCTTTTTTTTTATAGGGTC
TTATTCGTATCTAAGGCAGGCTAGGATTGCAGACATCCAATATGCTTAATTAGAAACATTCTTTTTATTTTTTAAACTCATGTCTTTTTTACAAGATGCCTACATATATCCTATTATGCCTGTTTTTAAATCCTTTTAAATCCTTTTTTTTAAGGT
CTGCTGTCTTCCTTCAGTTGTAATGGAAAGAAACACTATGTTGTAGAGGAAAATTTCTGAAAGTGATGATAAAGGGTTTGCTTGTACTGAATTCTCTCTCCTTGCTCTCCCCCCACGTGAGCATCTAGCTATCTATACGCTGCT
GGATGTATTTGACCGATGCCTGCTCCACTGGCACATTGCATGTGTGTGGTAGCCATGCCTTCTTGCTTCTCTCCCCCCCCAACCCCTATGCTCTACTCAGTGGTACAGATAGCTGGGATTATCACAATTTTGAGAGAAAC
ACCAATTTTAAAAGTTTTTTTCATATCACCATTTGCCCAGAAAACAGTTCTCTCAACTTGTTTGCAACATGTAATAATTTAAGAAACTCAATTTTTTTTGATAACTTCCTTAGATATCCCACATCCTAC
GTCAGTCCTTTGTCCTGAGGAACTGGTAAAATGGAAGCCCTTAGCGAACTGAAGGCATTCGCATGTGTGTAAGATAATCTCTCTCTTGCAAGGCTCTGGATGGCTCTCCCTACCAATATTGAACAATATTGAACAATATTCTCTGATT
TTGGCAAAATAAAGGATAATATTTT |
| Podkład do przodu | GAGAACCCACTGCTTAC |
| Odwrócony podkład | TTTTTTTTTTTTTTTTTTTTAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAA |
