Test monitorowania zakwaszenia jelit: technika badania zakwaszenia światła jelita u Drosophila przy użyciu niebieskiego barwnika bromofenolowego

W tym artykule

Streszczenie

Źródło: Abu, F., et al. Monitorowanie zakwaszenia jelit w jelicie dorosłej osoby rasy Drosophila. J. Vis. Exp. (2021).

Ten film demonstruje test do monitorowania zakwaszenia jelit u muszek Drosophila. Po spożyciu pokarmu uzupełnionego barwnikiem wskaźnikowym pH, zakwaszenie światła jelita powoduje zmianę koloru barwnika. Oględziny przewodu pokarmowego much w celu zbadania zmiany koloru dostarczają dowodów na zakwaszenie.

Protokół

UWAGA: Standardowa linia laboratoryjna Oregon R została użyta jako kontrola WT. Wszystkie muchy hodowano na standardowym podłożu z mąki kukurydzianej i melasy (zawierającej melasę, agar, drożdże, mąkę kukurydzianą, tegosept, kwas propionowy i wodę) w temperaturze pokojowej z 12/12 godzinnym jasnym/ciemnym rytmem okołodobowym.

1. Przygotowanie do testu

Zbierz samice much (w wieku 0-2 dni, nie dziewicze) w znieczuleniu CO₂ i pozwól im dojść do siebie na standardowym pokarmie z mąki kukurydzianej przez co najmniej 3 dni przed eksperymentami.
Głodz muchy przez ~ 24 godziny w temperaturze pokojowej (~ 23 °C) w fiolkach zawierających laboratoryjną chusteczkę nasączoną ~ 2 ml wody dejonizowanej.
Przygotuj pokarm dla much z błękitem bromofenolowym (BPB) w następujący sposób:
1. Rozpuść pokarm na muchy w kuchence mikrofalowej, a następnie pozwól mu ostygnąć, aż będzie letni.
2. Dodaj 1 ml 4% BPB do 1 ml letniego jedzenia i dobrze wymieszaj.
3. Za pomocą pipety dodaj pokarm na muchy zawierający BPB do jednej kropki (~200 μl) na środku szalki Petriego.

2. Test monitorowania zakwaszenia jelit

Przenieś wygłodzone muchy na szalkę Petriego zawierającą pojedyncze kropki (200 μl) pokarmu dla much uzupełnionego 2% błękitem bromofenolowym (BPB). Pozwól muchom żerować przez 4 godziny w temperaturze pokojowej pod wpływem światła.
Po 4 godzinach zbierz muchy i znieczul je na lodzie; chirurgicznie odizoluj ich wnętrzności.
1. Wykonaj operację w 1x soli fizjologicznej buforowanej fosforanami (PBS) za pomocą kleszczy pod mikroskopem stereoskopowym (patrz tabela materiałów). Odizoluj jelito, przytrzymując klatkę piersiową parą kleszczy i ciągnąc w dół brzucha drugą parą, aż CCR jelita będzie widoczny, uważając, aby jelito pozostało przyczepione na obu końcach.
Określ zakwaszenie jelita, badając kolor CCR jelita (ryc. 1C; żółty oznacza zakwaszony, a niebieski oznacza niezakwaszony).
Policz tylko te muchy, które wykazują silne zabarwienie BPB w jelitach.
Oblicz wartość procentową, korzystając z następującego równania:
Odsetek much z zakwaszonymi jelitami = liczba much zakwaszonych × 100 / (liczba much zakwaszonych + liczba much niezakwaszonych)
nuta: Procent 0 oznacza, że żadna mucha nie zakwasiła swoich jelit, podczas gdy procent 100 oznacza, że wszystkie muchy zakwasiły swoje jelita.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

figure-results-1
Rycina 1: Monitorowanie zakwaszenia jelit.(A) Schematyczny rysunek areny karmienia. Niebieska kropka reprezentuje pokarm dla much z błękitem bromofenolowym (barwnikiem wskazującym pH). Inne plamki reprezentują muszki owocówki. (B) Graficzne przedstawienie procentu much wykazujących zakwaszenie jelit karmionych przez różne okresy w ciągu 4 godzin. Reprezentatywne obr...