Mitochondrialny test wychwytu wapnia: metoda pomiaru wychwytu wapnia w izolowanych mitochondriach oparta na czytniku płytkowym

Streszczenie

Źródło: Maxwell, J.T., i wsp., Analizy napływu mitochondrialnego wapnia w izolowanych mitochondriach i hodowanych komórkach. J. Vis. Exp. (2018).

Ten film opisuje test oparty na czytniku płytek do pomiaru mitochondrialnego wychwytu wapnia w izolowanych mitochondriach. Test analizuje sygnał fluorescencyjny wrażliwego na wapń barwnika fluorescencyjnego w celu zbadania kinetyki mitochondrialnego wychwytu wapnia i przeciążenia wapniem.

Protokół

1. Odczynniki i roztwory

1. Przygotować 500 ml buforu MS-EGTA do izolacji mitochondriów: 225 mM mannitolu, 75 mM sacharozy, 5 mM kwasu 4-(2-hydroksyetylo)-1-piperazynoetanosulfonowego (HEPES), 1 mM glikolu etylenowego-bis(β-aminoetyloeter)-N,N,N',N'-tetraoctowego (EGTA), pH dostosowane do 7,4 za pomocą KOH. Wysterylizuj go przez filtr 0,22 μm i przechowuj w temperaturze 4 °C. Upewnij się, że bufor MS-EGTA jest wstępnie schłodzony do 4 °C przed użyciem.
2. Przygotuj 100 ml buforu KCl: 125 mM KCl, 20 mM HEPES, 1 mM KH₂PO₄, 2 mM MgCl₂, 40 μM EGTA i pH dostosowane do 7,2 za pomocą KOH. Przechowuj go w temperaturze pokojowe....

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
Synergy Neo2 Wielomodowy czytnik mikropłytek z wtryskiwaczami	Biotek
	Kimble	886000-0022
Płytka 96-dołkowa	Corning	3628
Calcium Green-5N	Invitrogen	C3737
DMSO	Invitrogen	D12345
HEPES	Sigma	H3375
EGTA	Sigma	E8145
Chlorek potasu	Fisher	BP366-500
Chlorek magnezu	Sigma	M2670
Pirogronian sodu	Sigma	P2256
Kwas L-jabłkowy	Sigma	M1125
Chlorek wapnia	Sigma	C4901
Potas fosforan jednozasadowy	Sigma	P0662

Homogenizator tkankowy