1. Odczynniki i roztwory
- Przygotować 500 ml buforu MS-EGTA do izolacji mitochondriów: 225 mM mannitolu, 75 mM sacharozy, 5 mM kwasu 4-(2-hydroksyetylo)-1-piperazynoetanosulfonowego (HEPES), 1 mM glikolu etylenowego-bis(β-aminoetyloeter)-N,N,N',N'-tetraoctowego (EGTA), pH dostosowane do 7,4 za pomocą KOH. Wysterylizuj go przez filtr 0,22 μm i przechowuj w temperaturze 4 °C. Upewnij się, że bufor MS-EGTA jest wstępnie schłodzony do 4 °C przed użyciem.
- Przygotuj 100 ml buforu KCl: 125 mM KCl, 20 mM HEPES, 1 mM KH2PO4, 2 mM MgCl2, 40 μM EGTA i pH dostosowane do 7,2 za pomocą KOH. Przechowuj go w temperaturze pokojowej.
- Przygotować 1 mM bulionu zieleni wapniowej-5N w dimetylosulfotlenku (DMSO). Zielony wapń-5N może być porcjowany i przechowywany w temperaturze -20 °C.
- Przygotuj podłoża do pobierania Ca2+.
- Przygotować 1 M pirogronian sodu o pH 7,4. Przechowywać go w porcjach w temperaturze -20 °C.
- Przygotować 500 mM jabłczanu o pH 7,4. Przechowywać go w porcjach w temperaturze -20 °C.
2. Izolacja mitochondriów serca
- Poddaj mysz eutanazji zgodnie ze standardami instytucjonalnymi.
UWAGA: W przypadku naszej instytucjonalnie zatwierdzonej metody eutanazji, myszy zostały znieczulone przez inhalację izofluoranu i złożone w ofierze przez zwichnięcie szyjki macicy.
- Zbierz serce, otwierając jamę klatki piersiowej, przecinając wzdłuż obu stron żeber, flankując serce, odcinając przeponę i wycinając tkankę serca.
UWAGA: W tym protokole izolacja mitochondriów jest wykonywana z całego serca pobranego od dorosłej myszy (około 120 mg), co powinno wystarczyć na 3-4 eksperymenty. Do izolacji mitochondriów z innych tkanek bogatych w mitochondria, takich jak wątroba, można użyć do 200 mg tkanki zgodnie z opisanym protokołem.
- Dokładnie wypłucz tkankę w 25 ml lodowatego 1x soli fizjologicznej buforowanej fosforanem (PBS), upewniając się, że cała krew została wyciśnięta z komór.
UWAGA: Serce zostanie wystarczająco wypłukane, gdy płyn wyciśnięty z serca będzie czysty.
- Zmiel serce na małe kawałki w 5 ml lodowatego 1x PBS za pomocą ostrych nożyczek.
- Wyrzucić PBS i przenieść zmieloną tkankę serca do wstępnie schłodzonego homogenizatora szklano-teflonowego o pojemności 7 ml z odstępem od 0,10 do 0,15 mm.
- Dodać 5 ml lodowatego buforu MS-EGTA i homogenizować próbkę, aż fragmenty tkanki przestaną być widoczne (około 11 uderzeń).
UWAGA: Nie homogenizuj nadmiernie tkanki, ponieważ celem jest uzyskanie nienaruszonych i funkcjonalnych mitochondriów.
- Przenieść homogenat do probówki o pojemności 15 ml.
- Odwirować homogenat w temperaturze 600 x g w temperaturze 4 °C przez 5 minut, aby uzyskać jądra i nieuszkodzone komórki.
- Przenieść supernatant do świeżej probówki o pojemności 15 ml i odwirować go w temperaturze 10 000 x g w temperaturze 4 °C przez 10 minut w celu osadzenia mitochondriów.
- Odrzucić supernatant i utrzymać osad mitochondrialny na lodzie.
- Przemyć osad mitochondrialny dwukrotnie za pomocą lodowatego buforu MS-EGTA. Przy każdym przemyciu ponownie zawiesić mitochondrialny osad w 5 ml buforu MS-EGTA, odwirować go w temperaturze 10 000 x g w temperaturze 4 °C przez 10 minut i odrzucić supernatant.
- Po ostatnim płukaniu wyrzucić supernatant i ponownie zawiesić mitochondria w 100 μl lodowatego buforu MS-EGTA. Utrzymuj mitochondria na lodzie.
UWAGA: Mitochondria powinny być używane do eksperymentów w ciągu 1 godziny.
- Zmierz stężenie białka mitochondrialnego za pomocą testu białka Bradforda.
3. Pomiar mitochondrialnego wychwytu wapnia za pomocą czytnika płytek
UWAGA: Tutaj opisano protokół analizy wychwytu mitochondrialnego Ca2+ za pomocą wielomodowego czytnika płytek wyposażonego we wtryskiwacze. Można zastosować dowolny czytnik płytek z możliwością odczytu fluorescencji zieleni wapniowej-5N (wzbudzenie/emisja 506/532 nm) w trybie kinetycznym z automatycznymi wtryskiwaczami odczynników w celu ochrony reakcji przed światłem.
- Zaprogramuj czytnik płytek tak, aby wykonywał kinetyczny odczyt fluorescencji zieleni wapniowej-5N z pomiarami wykonywanymi co sekundę przez całkowity czas oznaczania 1,000 s. Dodatkowo zaprogramuj wtryskiwacze odczynników tak, aby dozowały 5 μl roztworu CaCl2 w punktach czasowych 30 s, 150 s, 300 s, 480 s i 690 s.
UWAGA: Czas wstrzyknięć CaCl2 jest zdefiniowany przez użytkownika i może być dostosowany do potrzeb eksperymentalnych.
- Zalać wtryskiwacze odczynników roztworem CaCl2, który ma być użyty.
UWAGA: Stężenie roztworu CaCl2 jest definiowane przez użytkownika i może być dostosowywane w kolejnych seriach w celu miareczkowania ilości Ca2+ wymaganej do uruchomienia otwarcia MPTP.
- Dodaj 200 μg mitochondriów do pojedynczego dołka na 96-dołkowej płytce.
- Dodaj odpowiednią objętość buforu KCl do studzienki tak, aby całkowita objętość mitochondriów i bufora KCl wyniosła 197 μL.
- Dodać 1 μl 1 M pirogronianu i 1 μl 500 mM jabłczanu do mieszaniny mitochondriów. Delikatnie odpipetować, aby wymieszać i inkubować mitochondria z substratami przez 2 minuty w temperaturze pokojowej, aby mitochondria mogły się pobudzić.
- Dodać 1 μl 1 mM bulionu zieleni wapniowej-5N. Delikatnie wymieszać, pipetując.
UWAGA: Chroń reakcję przed światłem po dodaniu barwnika zieleni wapniowej-5N.
- Uruchom wstępnie zaprogramowany protokół kinetyczny i monitoruj fluorescencję zieleni wapniowej-5N.
