1. Przygotowanie dużych pęcherzyków jednowarstwowych (LUV)
- Przygotuj LUV do użycia jako naśladownictwo błony komórkowej do testu nieszczelności fluorescencji.
- Wymieszać szklaną strzykawką Hamilton fosfatydylocholinę (DOPC, 786,11 g/mol), sfingomielinę (SM, 760,22 g/mol) i cholesterol (Chol, 386,65 g/mol) w stosunku molowym 4:4:2. Roztwór lipidów otrzymuje się z roztworu podstawowego każdego lipidu rozpuszczonego w rozpuszczalniku metanol/chloroform (3/1; objętość/objętość) w stężeniu 25 mg/ml w szklanej kolbie okrągłodennej o pojemności 25 ml. Na podstawie 4 μmol DOPC, 4 μmol SM i 2 μmol Chol, roztwór lipidów otrzymuje się z roztworu podstawowego przez zmieszanie odpowiednio 126 μl, 117 μl i 31 μl.
ostrożność: Metanol jest toksycznym i łatwopalnym rozpuszczalnikiem, a chloroform jest toksyczny i rakotwórczy. Oba powinny być obsługiwane z odpowiednią ochroną pod maską.
- Odparować metanol/chloroform za pomocą wyparki obrotowej w próżni przez 45-60 minut w temperaturze 60 °C, aż do powstania wysuszonego filmu lipidowego.
- Przygotować dwa podstawowe roztwory buforowe HEPES. Przygotować bufor HEPES 1, mieszając 20 mM HEPES (238,3 g/mol) i 75 mM NaCl (58,44 g/mol) i dostosować pH do 7,4. Przygotować bufor HEPES 2, mieszając 20 mM HEPES i 145 mM NaCl i dostosować pH do 7,4. HEPES mogą być przechowywane w temperaturze 4 °C przez 1 miesiąc.
nuta: Zaleca się sprawdzenie osmolarności za pomocą osmometru.
- Przygotować roztwór hydratacji lipidów, rozpuszczając nieprzepuszczalną dla błony parę fluorescencyjną z wygaszaczem barwników, kwas 8-aminonaftaleno-1,3,6-trisulfonowy, sól disodową w stężeniu 12,5 mM (ANTS, 427,33 g/mol) i bromek p-ksylen-bispirydyny w stężeniu 45 mM (DPX, 422,16 g/mol) w roztworze buforowym HEPES. Zmieszanie ANTS z DPX prowadzi do powstania roztworu o żółtym zabarwieniu. Aby osiągnąć stężenia 12,5 mM ANTS i 45 mM DPX, rozpuść odpowiednio 21,4 mg i 76 mg w 4 ml buforu HEPES 1,
nuta: Lipidowy roztwór hydratujący można przechowywać przez 2 tygodnie w temperaturze 4 °C, owijając probówkę folią aluminiową.
- Rozpuść pęcherzyki wielopłytkowe (MLV) poprzez ponowne zawieszenie wysuszonego filmu lipidowego z 1 ml roztworu lipidowego i wirowanie aż do rozpuszczenia wysuszonego filmu lipidowego. Upewnij się, że roztwór jest całkowicie rozpuszczony, ponieważ małe agregaty lipidowe negatywnie wpłyną na poprzednie kroki. Sprawdź również ściankę szklanej kolby okrągłodennej, aby upewnić się, że nie pozostał film lipidowy.
nuta: Po rozpuszczeniu roztwór będzie opalizujący i jasnożółty.
- Poddaj pęcherzyki pięciu cyklom zamrażania/rozmrażania, aby uzyskać pęcherzyki jednopłytkowe. Wykonaj każdy cykl, umieszczając szklaną kolbę okrągłodenną na 30 s w ciekłym azocie do etapu zamrażania, a następnie pozostawiając ją w łaźni wodnej na 2 minuty w celu etapu rozmrażania.
nuta: Temperatura wody w kąpieli powinna być o 5-10°C wyższa niż temperatura topnienia lipidów.
- Przygotuj wytłaczarkę lipidową, wkładając dwie podpory filtracyjne wstępnie nawilżone buforem HEPES w każdym elemencie wytłaczarki z politetrafluoroetylenu (PTFE) umieszczonym w metalowym kanistrze wytłaczarki.
- Umieść nawilżaną membranę poliwęglanową HEPES (wielkość porów 0,1 μm, średnica 25 mm) na jednym wsporniku filtra.
- Zmontuj dwa metalowe kanistry wytłaczarki i przykręć je.
- Umieść zmontowaną wytłaczarkę w uchwycie i wprowadź strzykawkę o pojemności 1 ml do odpowiedniego otworu na końcu każdego elementu wytłaczarki z politetrafluoroetylenu. Wytłaczanie odpowiada przejściu badanej cieczy z jednej strzykawki do drugiej przez membranę poliwęglanową.
- Przetestuj wytłaczarkę z 1 ml buforu HEPES załadowanym do jednej ze strzykawek o pojemności 1 ml, aby upewnić się, że nie ma wycieków ani problemów.
- Zastąp 1 ml bufor HEPES próbką MLV.
- Przeprowadzić ekstruzję, przepuszczając próbkę MLV z jednej strzykawki do drugiej przez membranę poliwęglanową co najmniej 21 razy, aby uzyskać jednolite LUV o tym samym rozmiarze.
nuta: Wytłaczanie powinno odbywać się w temperaturze wyższej niż temperatura topnienia mieszaniny lipidowej.
2. Oczyszczanie LUV
- Przygotuj oczyszczanie kolumny, aby usunąć nadmiar niezamkniętych w kapsułkach ANTS i DPX.
- Wprowadzić usieciowany żel dekstranowy (G-50) zawieszony w środowisku wodnym z 0,01% NaN3 (65 g/mol) w kolumnie do chromatografii cieczowej (Luer Lock, bez płaszcza, 1,0 cm x 20 cm, objętość złoża 16 ml) do 1 cm poniżej górnej części bezbarwnej części kolumny.
- Otwórz kran i pozwól płynowi spłynąć, aby osadzić usieciowany żel dekstranowy.
- Przemyć kolumnę przez elucję 20 ml buforu HEPES 2 i odrzucić wyjściowy przepływ kolumny.
- Zamknąć kran, gdy martwa objętość rozpuszczalnika nad kolumną zostanie zminimalizowana (<100 μl), ale wystarczająca, aby uniknąć wysuszenia usieciowanego żelu dekstranowego.
- Umieść świeżo wytłaczane LUV (żółte) na kolumnie i pozwól im wejść do usieciowanego żelu dekstranowego.
- Ciągle dodawaj bufor HEPES 2 do kolumny, aby przeprowadzić oczyszczanie LUV.
- Eluować około 2 ml buforu HEPES 2 (nie zapomnij regularnie napełniać górnej części kolumny, aby uniknąć wysuszenia usieciowanego żelu dekstranowego): wolny żółty roztwór ANTS i DPX migruje wolniej niż liposomy.
- Zacznij zbierać oczyszczone LUV w probówkach (1,5 ml).
- Obserwuj krople eluentu z kolumny, a gdy staną się opalizujące, zawierają liposomy. Wymień probówkę, aby odzyskać frakcję zawierającą LUV.
- Eluty, aż krople przestaną opalizować (~1 ml). Następnie eluuj kolejne 0,5 ml w oddzielnej frakcji, a następnie przestań eluować.
UWAGA: Wzorce są teraz dostępne w szerokim zakresie mas cząsteczkowych, jako zestawy lub pojedyncze masy cząsteczkowe do kalibracji objętości elucji LUV.
- Owiń probówki z LUV folią aluminiową, aby uniknąć wybielania barwnika fluorescencyjnego.
- Przemyć kolumnę 20 ml buforu HEPES 2.
- LUV można następnie przechowywać przez tydzień w temperaturze 4 °C.
UWAGA: Ponieważ stabilność LUV może zależeć od stężenia i składu LUV, a także od siły jonowej, rozmiar LUV powinien być kontrolowany za pomocą przyrządu do dynamicznego rozpraszania światła (DLS) (patrz sekcja 4. Charakterystyka wielkości i jednorodności LUV) przed każdym badaniem.
3. Kwantyfikacja stężenia LUV
- Oszacować stężenie LUV za pomocą zestawu do oznaczania ilościowego fosfolipidów, który umożliwia ocenę stężenia choliny. Test ten może być stosowany, gdy fosfolipidy z choliną zawierającą głowę polarną są znaczne (>50% LUV).
- Przygotować odczynnik barwiący, rozpuszczając 18 mg substratu chromogenu w 3 ml dostarczonego buforu.
- Załaduj kuwetę polistyrenową o wymiarach 10 x 10 x 45 mm 3 ml odczynnika barwiącyego.
- Użyj odczynnika o czystym kolorze jako stanu ślepej (ślepej). Dodać 20 μl próbki LUV (test) lub 20 μl roztworu wzorcowego o znanym stężeniu choliny (wzorzec).
- Dobrze wymieszać i inkubować przez 5 minut w temperaturze 37 °C we wszystkich warunkach (ślepa próba, test i standardowa).
- Zmierzyć absorbancję (gęstość optyczną, OD) badanej próbki i roztworu wzorcowego za pomocą roztworu ślepej próby jako próby kontrolnej przy długości fali 600 nm za pomocą spektrofotometru.
- Sprawdź wartości OD, które pozwalają oszacować stężenie lipidów w LUV, C[LUV], w ekwiwalencie choliny w porównaniu ze wzorcem znanego stężenia.
- Obliczenia należy wykonać, korzystając z następującego równania:
C[LUV] (mol / l) = (próbka OD / wzorzec OD) x C[Wzorzec] (mol / l)
UWAGA: Zestaw do oznaczania ilościowego fosfolipidów zawierał roztwór wzorcowy chlorku choliny (139,6 mg / l) o stężeniu 54 mg / dl odpowiadającym stężeniu molowemu C [Standard] = 3,87 mmol / L. Próbka OD i wzorzec OD to absorbancje zmierzone przy 600 nm odpowiednio dla roztworów LUV i choliny.
4. Charakterystyka wielkości i jednorodności LUV
- Wykonaj pomiar za pomocą przyrządu DLS w celu określenia wielkości LUV (w nm) i wskaźnika polidyspersyjności (PdI).
- Zaprogramuj odpowiednią "standardową procedurę operacyjną" (SOP), wskazując lepkość rozpuszczalnika/buforu i użytej kuwety.
- Umieścić 500 μl roztworu LUV w polistyrenowej półmikrokuwecie.
- Włóż polistyrenową półmikrokuwetę do instrumentu DLS.
- W temperaturze pokojowej należy zmierzyć rozkład wielkości pod względem średniej wielkości (Z-średniej) rozkładu cząstek i jednorodności (wskaźnik polidyspersyjności, PdI).
- Wszystkie wyniki uzyskano z dwóch niezależnych pomiarów wykonanych każdy w trzech powtarzających się cyklach.
UWAGA: Standardowe wartości dla LUV będą miały średnią wielkość 137 ± 7 nm przy PdI 0,149 ± 0,041.
5. Przygotowanie roztworów peptydowych
- Przygotować roztwór podstawowy peptydu, który należy przeanalizować do testu nieszczelności.
- Rozpuść peptyd w proszku (czystość >95%) w czystej wodzie (np. 1 mg peptydu w 500 μl czystej wody).
nuta: Zaleca się rozcieńczanie peptydów w czystej wodzie i unikanie rozpuszczania dimetylosulfotlenku (DMSO), które mogłoby wywołać artefakty (np. przepuszczalność błony).
- Wiruj roztwór peptydowy przez 5 sekund.
- Sonikować roztwór peptydu w wodnej kąpieli sonizacyjnej przez 5 minut, a następnie wirować przez 5 minut przy 12,225 x g. Zebrać szwadron nad osadem w celu oznaczenia stężenia.
- Zmierzyć absorbancję przy 280 nm trzech niezależnych rozcieńczeń peptydów, a następnie obliczyć stężenie peptydu, korzystając z jego molowego współczynnika ekstynkcji ε (w zależności od zawartości tryptofanu i tyrozyny w sekwencji peptydowej) i reguły Beera-Lamberta.
nuta: Jeśli peptyd zawiera tryptofan i tyrozynę, współczynnik ekstynkcji molowej ε oblicza się na podstawie tryptofanu ε = 5,690 M-1 cm-1 i tyrozyny ε = 1,280 M-1 cm-1. Jeśli sekwencja peptydowa nie zawiera tryptofanu ani tyrozyny, można przeprowadzić inne testy kolorymetryczne w celu zmierzenia stężenia (np. BCA lub Bradford).
- Rozcieńczyć roztwór peptydu w czystej wodzie do końcowego roztworu 100 μM i przechowywać w temperaturze 4 °C.
nuta: W czystej wodzie podczas przechowywania w temperaturze 4 °C nie dochodzi do degradacji peptydów. Jednak stężenie peptydów należy mierzyć co 2 tygodnie, aby upewnić się, że nie dojdzie do parowania wody.
6. Test nieszczelności fluorescencji
- Test nieszczelności fluorescencji mierzy się na spektrofluorometrze w temperaturze pokojowej. Długość fali wzbudzenia i emisji jest ustalona odpowiednio na Ex = 360 nm ± 3 nm i Em = 530 nm ± 5 nm.
- Rozcieńczyć LUV w 1 ml buforu HEPES 2 do końcowego stężenia 100 μM w kwarcowej kuwecie fluorescencyjnej. Dodaj mieszadło magnetyczne, aby homogenizować roztwór podczas eksperymentu.
- Zmierz same LUV w ciągu pierwszych 100 s, między t = 0 s a t = 99 s, aby uzyskać dostęp do fluorescencji tła.
nuta: Podczas całego eksperymentu (15 minut) można było również mierzyć same LUV, aby uzyskać dostęp do fluorescencji tła i potencjalnych wycieków.
- Następnie zmierz nieszczelność jako wzrost intensywności fluorescencji po dodaniu podwielokrotności roztworu peptydu przez następne 900 s (15 min). Protokół ten przeprowadza się dla każdego stężenia badanego peptydu od 0,1 μM do 2,5 μM.
- Ostatecznie 100% fluorescencję osiągnięto poprzez solubilizację LUV przez dodanie 1 μl Triton X-100 (0,1%, v/v), w wyniku czego uzyskano całkowicie niewygaszoną sondę między t = 1000 s a t = 1,100 s.
7. Kwantyfikacja wycieku
- Pomijaj wartości uzyskane po t = 1,090 s, aby zachować tę samą liczbę punktów dla każdego badanego warunku.
- Obliczyć minimalną fluorescencję, Fmin, uzyskując średnią z 50 punktów między t = 0 s a t = 49 s (same LUV).
- Obliczyć maksymalną fluorescencję, Fmax, uzyskując średnią z 50 punktów między t = 1,041 s a t = 1,090 s (LUV z Triton X-100).
- Obliczyć procent wycieku (%Leak) w każdym punkcie czasowym (t = x), zgodnie z następującym równaniem:
%Leak(t=x) = (F(t=x) - Fmin) / (Fmax - Fmin) x 100
- Obliczyć średnią i odchylenie standardowe dla wartości uzyskanych przy różnym przygotowaniu LUV (n ≥ 2) dla tego samego stanu.
- Wykreślić procent wycieku, %Leak(t=x), w funkcji czasu (s).
