1. Zbieranie i przetwarzanie roślin
- Pobieranie i przetwarzanie próbek z roślin
- Po pobraniu próbek roślinnych należy je błyskawicznie zamrozić, zanurzając materiał roślinny w ciekłym azocie za pomocą kleszczy i przechowywać w temperaturze -80 °C. Jeżeli pobrane próbki roślin są zbyt duże, aby można je było błyskawicznie zamrozić, należy je szybko schłodzić suchym lodem i jak najszybciej przenieść do zamrażarki o temperaturze -80 °C. Zawartość makroskładników odżywczych w materiale roślinnym może ulec zmianie po oddzieleniu tkanek od rośliny, dlatego ważne jest, aby zamrozić próbki roślinne tak szybko, jak to możliwe po pobraniu.
UWAGA: Ciekły azot może powodować silne odmrożenia w kontakcie ze skórą. Upewnij się, że przewozisz ciekły azot w zatwierdzonych pojemnikach i noś odpowiednie środki ochrony osobistej podczas jego obsługi, w tym rękawice kriogeniczne, gogle do oczu, osłonę twarzy, fartuch i fartuch laboratoryjny.
- Liofilizuj materiał roślinny za pomocą liofilizatora, aby upewnić się, że tkanki są metabolicznie nieaktywne podczas usuwania wody. Suszyć, aż masa próbki ustabilizuje się, aby upewnić się, że cała woda została usunięta.
- Po wyschnięciu próbek zmielić na drobny proszek za pomocą młynka lub młynka. Próbki należy przechowywać w komorze osuszającej do czasu analizy.
2. Test białka rozpuszczalnego
- Przygotowanie próbki
- Odważyć powtórzone próbki każdej tkanki, około 20 mg każda, do probówek do mikrowirówek z polistyrenu o pojemności 1,5 ml i probówek do etykietowania. Próbki te będą następnie określane jako próbki nieznane. Należy zanotować dokładną masę każdej próbki, ponieważ informacje te będą niezbędne do obliczenia % rozpuszczalnego białka w każdej nieznanej próbce. Używaj probówek do mikrowirówek z zamykanymi pokrywkami, ponieważ nieblokujące się pokrywki mogą się otworzyć podczas kolejnego etapu ogrzewania, powodując utratę roztworu próbki.
- Rozpuszczanie i izolowanie nieznanych próbek białek
- Za pomocą mikropipetora dodać 500 μl 0,1 M NaOH do każdej probówki. Zamknij szczelnie pokrywki i sonikuj przez 30 minut. Podgrzej gorącą kąpiel wodną 90 °C.
UWAGA: Wodorotlenek sodu jest mocną zasadą i może powodować oparzenia w kontakcie ze skórą. Chociaż 0,1 M NaOH reprezentuje niskie stężenie, należy nosić rękawice ochronne, aby uniknąć podrażnienia skóry.
- Umieść probówki na stojaku w gorącej kąpieli wodnej na 15 minut.
- Probówki wirować o masie 15 000 x g przez 10 minut. Odpipetować ciecz sklarowaną nad osadem do nowych, oznakowanych probówek do mikrowirówek, używając nowej końcówki pipety do każdej próbki. Dodać 300 μl 0,1 M NaOH do probówki zawierającej osad i ponownie odwirować przy 15 000 x g przez 10 minut. Ponownie zebrać ciecz sklarowaną nad osadem i połączyć ją z innym płynem sklarowanym nad osadem z tej samej próbki. Jest to potencjalny punkt zatrzymania, a w razie potrzeby próbki można przechowywać w temperaturze 4 °C przez noc.
- Wytrącić białka roślinne
- Zneutralizować pH roztworu sklarowanego nad osadem, dodając 11 μl 5,8 M HCl. Potwierdzić pH ~7, zanurzając papierek lakmusowy w każdym roztworze próbki.
UWAGA: Kwas solny jest silnie kwasem, który może powodować oparzenia w kontakcie ze skórą (aplikacja na skórę lub wdychanie). Należy nosić rękawice, aby zapobiec podrażnieniu skóry podczas obchodzenia się z HCl.
- Dodać 90 μl 100% kwasu trójchlorooctowego (TCA) do każdej probówki i inkubować probówki na lodzie przez 30 minut. Wytrącanie się białek zmieni roztwór z klarownego na nieprzezroczysty. Jeśli nie nastąpi to po 30 minutach, wstaw rurki do lodówki na 1 godzinę. Jest to potencjalny punkt zatrzymania, a w razie potrzeby próbki można przechowywać w temperaturze 4 °C przez noc.
UWAGA: Kwas trójchlorooctowy jest. Podczas obchodzenia się z produktem należy nosić rękawice, aby zapobiec kontaktowi ze skórą i uniknąć wdychania.
- Odwirować próbki o masie 13 000 x g przez 10 minut w temperaturze 4 °C. Ostrożnie usunąć supernatant TCA, odsysając go za pomocą przewodu próżniowego przymocowanego do końcówki mikropipety z drobnego szkła (ta sama końcówka może być używana do próbek). Nie należy naruszać osadu białkowego, unikając silnego zasysania i zachowując odpowiednią odległość między końcówką pipety a osadem.
- Szybko przemyć granulat 100 μl acetonu o temperaturze -20 °C. Ten krok usuwa wszelkie pozostałe TCA z osadu, co może zakłócać późniejszy test Bradforda; Jednak aceton zacznie rozpuszczać osad białka, jeśli pozostanie w kontakcie zbyt długo, dlatego należy dodać aceton, a następnie szybko wyekstrahować go z osadu w ciągu 5 sekund.
- Poczekaj, aż aceton odparuje, umieszczając rurki w dygestoriach lub lodówce. Następnie rozpuść osad białka, dodając 1 ml 0,1 M NaOH do każdej probówki. Całkowite rozpuszczenie osadu może wymagać kilku rund ogrzewania w gorącej kąpieli wodnej, wirowania i sonikacji.
UWAGA: Im dłużej rurki pozostają w dygestorium lub lodówce i im bardziej suche stają się granulki, tym trudniej będzie je ponownie rozpuszczone. Zaleca się suszenie osadu przez 30 minut, a następnie sprawdzanie obecności acetonu co 10-15 minut, aż stanie się jasne, że aceton wyparował (nie są wykrywalne opary acetonu).
- Wymieszać roztwory wzorcowe, rozcieńczyć nieznane roztwory próbek i określić ilościowo całkowitą zawartość białka w nieznanych próbkach za pomocą testu Bradforda.
- Przygotować roztwory wzorcowe bydlęcej immunoglobuliny G (IgG) zgodnie ze stężeniami wymienionymi w tabeli 1 (liofilizowany lub podstawowy roztwór IgG można mieszać z wodą dejonizowaną w celu uzyskania każdego stężenia). Przechowywać wzorce w temperaturze 4 °C. Na płytce 96-dołkowej dodać 160 μl każdego roztworu wzorcowego IgG w trzech powtórzeniach, zaczynając od pozycji A1 płytki dołkowej (0 μg/μL w pozycji A1, A2, A3, 0,0125 μg/μL w pozycjach B1, B2, B3 itd.).
- Przygotować rozcieńczony roztwór NaOH, dodając 50 μl 0,1 M NaOH do 950 μl wody destylowanej. Jako ślepą próbę kontroli ujemnej dodać 60 μl tego roztworu do płytki dołka w trzech egzemplarzach (pozycje G1, G2, G3).
- Przygotować rozcieńczenia nieznanych próbek, dodając 50 μl każdego roztworu próbki do 950 μl wody destylowanej w nowej probówce do mikrowirówek o pojemności 1,5 ml. Następnie dodać 60 μl każdej rozcieńczonej próbki do płytki studzienki w trzech egzemplarzach, zaczynając od pozycji H1. Płytka 96-dołkowa powinna pozwolić na analizę 6 wzorców, 1 ślepej próby i 25 nieznanych próbek odczytanych w trzech egzemplarzach. Każda analizowana płytka studzienki powinna zawierać własny wzorzec IgG i próbki ślepe.
- Dodać 100 μl wody destylowanej do wszystkich ślepych i nieznanych studzienek na próbki. Teraz każda studzienka powinna zawierać łącznie 160 μl. Za pomocą pipety wielokanałowej (8 kanałów) dodaj 40 μl barwnika białkowego Coomassie brilliant blue G-250 do każdego dołka w pierwszej kolumnie płytki dołka. Wymieszaj barwnik z próbkami, zanurzając go kilka razy. Powtórz tę czynność dla wszystkich pozostałych kolumn, wymieniając końcówki pipet, aby uniknąć zanieczyszczenia.
UWAGA: Coomassie brilliant blue G-250 jest drażniący i należy unikać kontaktu ze skórą, oczami lub płucami. Proszę nosić rękawice, aby zapobiec kontaktowi ze skórą. Jeśli dojdzie do kontaktu ze skórą, produkt ten będzie plamił.
- Użyj igły, aby przebić wszelkie pęcherzyki obecne w studzienkach, ponieważ mogą one zakłócać odczyt spektrofotometru mikropłytki. Wyczyść igłę, aby uniknąć zanieczyszczenia między studzienkami. Pozostaw mikropłytkę do inkubacji w temperaturze pokojowej przez 5 minut.
- Za pomocą spektrofotometru mikropłytkowego zapisać wartości absorbancji dla każdej studzienki przy długości fali 595 nm.
Tabela 1. Standardowe obliczenia krzywej dla testu białka rozpuszczalnego.Ilość białka w każdym wzorcu oblicza się, biorąc stężenie każdego wzorca i mnożąc je przez ilość roztworu wzorcowego w każdym dołku (160 μl).
pkt.
pkt.
jedn.
jezdnego
pkt.
| Stężenie IgG (μg/μL) | Białko w próbkach wzorcowych (μg) |
| 0,0000 | 0 |
| 0,0125 | cyfra arabska |
| 0,0250 | 4 |
| 0,0375 | 6 |
| 0,0500 | 8 |
| 0,1000 | 16 |
