Test kolorymetryczny do oznaczania ilościowego węglowodanów niestrukturalnych w tkankach roślinnych

Streszczenie

Źródło: Deans, C. A. et al. Ilościowe określanie zawartości białka rozpuszczalnego w roślinach i węglowodanów strawnych, na przykładzie kukurydzy (Zea mays). J. Vis. Exp. (2018).

Ten film opisuje metodę ilościowego oznaczania strawnych węglowodanów obecnych w tkankach roślinnych. Pomaga to zbierać dane z różnych tkanek roślinnych w celu badania ekologii żywieniowej, interakcji między roślinami a roślinożercami oraz dynamiki sieci pokarmowej.

Protokół

1. Zbieranie i przetwarzanie roślin

1. Po pobraniu próbek roślinnych należy je błyskawicznie zamrozić, zanurzając materiał roślinny w ciekłym azocie za pomocą kleszczy i przechowywać w temperaturze -80 °C. Jeżeli pobrane próbki roślin są zbyt duże, aby można je było błyskawicznie zamrozić, należy je szybko schłodzić suchym lodem i jak najszybciej przenieść do zamrażarki o temperaturze -80 °C. Zawartość makroskładników odżywczych w materiale roślinnym może ulec zmianie po oddzieleniu tkanek od rośliny, dlatego ważne jest, aby zamrozić próbki roślinne tak szybko, jak to możliwe po pobraniu.
   ostrożność: Ciekły azot może powodować silne odmrożenia w kontakcie ze skórą. Upewnij się, że przewozisz ciekły azot w zatwierdzonych pojemnikach i noś odpowiednie środki ochrony osobistej podczas jego obsługi, w tym rękawice kriogeniczne, gogle do oczu, osłonę twarzy, fartuch i fartuch laboratoryjny.
2. Liofilizuj materiał roślinny za pomocą liofilizatora, aby upewnić się, że tkanki są metabolicznie nieaktywne podczas usuwania wody. Suszyć, aż masa próbki ustabilizuje się, aby upewnić się, że cała woda została usunięta.
3. Po wyschnięciu próbek zmielić na drobny proszek za pomocą młynka lub młynka. Próbki należy przechowywać w komorze osuszającej do czasu analizy.

2. Test strawnych węglowodanów

1. Przygotowanie próbki
   1. Odważyć powtórzone próbki każdej tkanki, około 20 mg każda, do szklanych probówek o pojemności 15 ml z gumowymi nakrętkami (o długości 100 mm). Próbki te będą następnie określane jako próbki nieznane. Oznaczyć probówki wodoodpornym markerem lub taśmą etykietową na wieczkach i zanotować dokładną masę każdej próbki, ponieważ informacje te będą wymagane do obliczenia zawartości % węglowodanów w każdej nieznanej próbce.
2. Ekstrahować strawne węglowodany z każdej nieznanej próbki.
   1. Dodać 1 ml 0,1 M H₂SO₄ do każdej probówki i mocno zakręcić nakrętki na probówkach. Umieść we wrzącej łaźni wodnej na 1 godzinę.
      ostrożność: Kwas siarkowy jest bardzo. Podczas obchodzenia się z H₂SO₄ należy nosić rękawice, okulary i fartuch i wykonać tę czynność w wyciągu.
   2. Schłodzić rurki w letniej kąpieli wodnej. Wlej zawartość probówki do oznaczonych 1,5 ml probówek do mikrowirówek (nie martw się, jeśli w szklanych probówkach pozostanie trochę materiału roślinnego).
   3. Probówki wirować o masie 15 000 x g przez 10 minut. Usunąć ciekłość sklarowaną nad osadem za pomocą mikropipetora i umieścić w nowych, oznakowanych probówkach do mikrowirówek o pojemności 1,5 ml. W tym momencie rurki można schłodzić przez noc. Jeśli kontynuujesz badanie, zapoznaj się z krokiem 2.3.2.
3. Zmieszać roztwory wzorcowe i określić ilościowo całkowitą zawartość węglowodanów strawnych w nieznanych próbkach.
   1. Przygotować roztwory wzorcowe glukozy D(+) o stężeniach podanych w tabeli 1. Przygotować sześć szklanych probówek zawierających 400 μl każdego roztworu wzorcowego.
   2. Pobrać pipetę po 15 μl z każdej nieznanej próbki do osobnej probówki i dodać do każdej z nich 385 μl wody destylowanej, co daje całkowitą objętość 400 μl w każdej probówce. W dygestorium dodać 400 μl 5% fenolu do każdej probówki z próbką wzorcową i nieznaną, a następnie szybko odpipetować 2 ml stężonego_H2SO4 do każdej probówki. Nie dotykaj zawartości probówki końcówką pipety, wystarczy dodać do powierzchni roztworu (najlepiej sprawdza się do tego pipeta powtarzalna).
   3. Pozwól probówkom inkubować przez 10 minut, a następnie ostrożnie wiruj probówki, aby wymieszać zawartość. Inkubować przez dodatkowe 30 minut.
      ostrożność: Fenol i kwas siarkowy są substancjami drażniącymi. Aby chronić się przed narażeniem na kontakt ze skórą, oczami i wdychaniem ten krok należy wykonywać w okapie oparów chemicznych przy użyciu odpowiednich środków ochrony indywidualnej, które obejmują: osłonę twarzy lub gogle do oczu, gumowe rękawice, fartuch laboratoryjny i buty. Mieszanie fenolu z kwasem siarkowym powoduje również reakcję egzotermiczną, która spowoduje nagrzewanie się rurek.
   4. Pobrać pipetę 800 μl próbki z każdej probówki do każdej z 3 polistyrenowych półmikrokuwet o pojemności 1,5 ml (3 kontrpróby techniczne na próbkę). Ustaw spektrofotometr na odczyt przy 490 nm. Kalibrację do ślepej kuwety zawierającej wodę destylowaną przed odczytem wzorców lub nieznanych próbek oraz z przerwami podczas odczytów próbek. Przepuść każdą kuwetę przez spektrofotometr i zapisz absorbancję. Średnia z prób technicznych dla każdej nieznanej próbki.
      nuta: W niektórych przypadkach próbki mogą przekroczyć górny próg absorbancji. W takim przypadku próbki należy rozcieńczyć na etapie 1.3.1. Rozcieńczenia muszą być również uwzględnione w późniejszych obliczeniach.
   5. Oblicz średnią absorbancję dla każdego wzorca.
      nuta: Aby obliczyć ilość całkowitych węglowodanów trawialnych obecnych w każdej nieznanej próbce za pomocą krzywej wzorcowej, najłatwiej jest dokonać regresji średniej absorbancji każdego wzorca w stosunku do mikrogramów D(+)glukozy obecnych w każdym wzorcu, ale w razie potrzeby można również wykreślić stężenie D(+)glukozy (μg/μL) każdego wzorca. Poniższe obliczenia odnoszą się jednak do standardowej krzywej opartej na mikrogramach, a nie na stężeniach (μg/μl).
   6. Obliczyć krzywą wzorcową, wykreślając średnią absorbancję w stosunku do całkowitej ilości D(+)glukozy (μg) w każdym roztworze wzorcowym. Dopasuj linię regresji liniowej do tych danych, a następnie użyj poniższego równania, aby obliczyć całkowitą ilość węglowodanów (μg) w każdej nieznanej próbce:
      M_c = (((A_x – b)/m)/(15))*1000
      M_c = μg węglowodanów w próbce
      A_x = średnia absorbancja nieznanej próbki
      b = punkt przecięcia z osią Y (standardowa linia regresji)
      m = nachylenie (standardowa linia regresji)
      Współczynnik korelacji tej linii powinien być większy niż 0,98 i rutynowo bliski 0,99. Następnie użyj poniższego równania, aby określić procentową zawartość węglowodanów w każdej próbce:
      P_c = ((M_c/1000)/(M_i))*100
      P_c =%węglowodany
      M_i = masa początkowa próbki (mg)

Tabela 1. Obliczanie krzywej standardowej dla oznaczania węglowodanów strawnych. Ilość glukozy w każdym wzorcu oblicza się, biorąc stężenie każdego wzorca i mnożąc je przez ilość roztworu wzorcowego w każdej probówce (400 μl)

jedn. pkt. pkt. Rozdział jedn. Rozdział

Stężenie D(+)glukozy (ug/uL)	D(+)glukoza w próbkach wzorcowych (ug)
0,0000	0
0,0375	15
0,0750 ziarna	Rozdział 30
0,1125	Rozdział 45
0,1500	60
0,1875	75

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
Czytnik mikropłytek (spektrofotometr)	Model Bio-Rad	680 XR