Wszystkie procedury dotyczące modeli zwierzęcych zostały sprawdzone przez lokalny instytucjonalny komitet opieki nad zwierzętami oraz weterynaryjną komisję rewizyjną JoVE.
1. Test wzrostu Toksoplazmy na bazie lucyferazy
- Wysiewaj ludzkie fibroblasty napletka (HFF) na 1 tydzień przed inokulacją pasożyta, aby upewnić się, że komórki gospodarza są w pełni zlewne. Wykonaj próbny test na przezroczystej płytce, aby upewnić się, że pasożyty pozostają wewnątrzkomórkowe przez cały okres oceny.
nuta: W tym przypadku test przeprowadza się w 96-dołkowych mikropłytkach. W zależności od potrzeb eksperymentalnych można go skalować do mikropłytek 384 lub 1536-dołkowych.
- Przekaż pasożyty Toxoplasma do zbiegających się HFF na 2 dni przed użyciem, przenosząc ~0,3-0,4 ml w pełni zlizowanych pasożytów do kolby T25. Inkubować zakażone komórki gospodarza w temperaturze 37 °C z 5% CO2 przez 2 dni.
- Przetrzytrzyj strzykawkę 5 ml świeżo zmielonych pasożytów przez bezpieczną igłę 21 G 5x, aby uwolnić pasożyty wewnątrzkomórkowe, a następnie przepuść przez filtr 3 μm w celu usunięcia resztek komórek gospodarza. Wypłukać resztki pasożytów z kolby przy użyciu 7 ml pożywki D10 wolnej od czerwieni fenolowej, a następnie ponownie przepuścić przez filtr.
- Odwirować pasożyty w temperaturze 1000 x g przez 10 minut w temperaturze pokojowej (RT). Odlać supernatant i ponownie zawiesić osad w 10 ml pożywki D10 wolnej od czerwieni fenolowej.
- Policz pasożyty za pomocą hemocytometru, aby określić stężenie.
- Rozcieńczyć pasożyty do 1 x 104 pasożytów/ml dla szczepu typu dzikiego (WT). W przypadku szczepów pasożytów z niedoborem wzrostu, należy odpowiednio zwiększyć stężenie, aby zaobserwować znaczny wzrost sygnałów lucyferazy.
- Ostrożnie odessać pożywkę z 96 mikropłytek dołkowych wstępnie zasianych HFF i zaszczepić 150 μl resuspension pasożyta do studzienek w formacie trzech kolumn i pięciu rzędów, co odpowiada trzem powtórzeniom technicznym i pięciu punktom czasowym.
- Inkubować mikropłytkę w temperaturze 37 °C i 5% CO2 przez 4 godziny.
- Ostrożnie odessać pożywkę z dołków, aby usunąć niezaatakowane pasożyty, a następnie napełnić studzienki pożywką wolną od czerwieni fenolu RT w każdym rzędzie (z wyjątkiem pierwszego rzędu).
- Wymieszać równe objętości PBS i 2x bufor do oznaczania lucyferazy i rozcieńczyć substrat lucyferazy do 12,5 μM.
- Dodaj 100 μl rozcieńczonego substratu lucyferazy do każdego dołka w górnym rzędzie. Inkubować mikropłytki w temperaturze pokojowej przez 10 minut, aby umożliwić pełnej lizie komórek.
- Zmierz aktywność lucyferazy za pomocą czytnika mikropłytek. Ustawienia czytnika płytek są wymienione w tabeli 1. Każdy odczyt reprezentuje początkową liczbę zaatakowanych pasożytów po 4 godzinach od zakażenia.
- Powtarzaj kroki 1.9-1.12 dla każdego rzędu co 24 godziny przez 4 dni bez zmiany podłoża. Odczyty te odzwierciedlają całkowitą liczbę replikowanych pasożytów po 24 godzinach, 48 godzinach, 72 godzinach i 96 godzinach po zakażeniu.
- Oblicz średnie odczyty w każdym punkcie czasowym i podziel je przez średnie odczyty po 4 godzinach, aby określić zmiany w pofałdowaniu wzrostu pasożyta w czasie.
- Wykreśl dane za pomocą oprogramowania do tworzenia wykresów.
- Aby obliczyć czas podwajania, należy wykreślić wartości log2 zmian krotności w poszczególnych punktach czasowych w czasie inkubacji. Użyj funkcji regresji liniowej, aby obliczyć nachylenie, które reprezentuje czas podwojenia każdego odkształcenia.
Tabela 1: Ustawienia czytnika mikropłytek do pomiaru aktywności lucyferazy podczas testu wzrostu Toxoplasmy opartego na lucyferazie
| Lucyferaza: | punkt końcowy |
| Czas integracji: | 1 sekundy |
| Zestaw filtrów - emisja: | Pełne światło |
| optyka: | Do góry |
| korzyść: | 135 Rozdział 135 |
| Prędkość odczytu: | normalny |
| zwłoka: | Czas trwania: 100 ms |
| Wysokość odczytu: | 4,5 milimetra |
