Wszystkie procedury dotyczące modeli zwierzęcych zostały sprawdzone przez lokalny instytucjonalny komitet opieki nad zwierzętami oraz weterynaryjną komisję rewizyjną JoVE.
1. Uwalnianie endogennej monoaminy ex-vivo z wycinków mózgu lub ciosów
UWAGA: Urządzenie użyte w tej sekcji składa się z 48-dołkowej płytki i uchwytu na tkanki wykonanego z sześciu mikrowirówek filtrujących bez wbudowanych filtrów podłączonych do linii karbogenicznej (Rysunek 1). Aby wykonać uchwyt, użyj solidnego plastikowego pręta (np. ze skrobaka do komórek) i przyklej do niego jednostki filtrujące mikrowirówki bez wpuszczanych filtrów. Pozostaw do wyschnięcia na 1-2 dni. Czas potrzebny na eksperyment z endogennym uwalnianiem monoamin i stężenia amfetaminy, fluoksetyny i kokainy są oparte na aktualnej literaturze i poprzednich protokołach.
- Aktywacja tkanek
- Przenieś tkankę mózgową do każdej studzienki komory wypływowej i pozwól na regenerację przez 30-50 minut w temperaturze 37 °C na szkiełku podstawowym w 0,5-1 ml natlenionego buforu wypływowego, ze stałym, delikatnym bulgotaniem (ryc. 1B1).
- Podczas tej inkubacji rozcieńczyć leki do pożądanego stężenia w eksperymencie. Wszystkie leki muszą być rozpuszczone w buforze wypływowym, a stężenia są oparte na aktualnej literaturze.
- Pierwsza inkubacja
- Przenieść uchwyt na tkankę z tkanką mózgową do studzienek zawierających 500 μl natlenionego buforu wypływowego i inkubować przez 20 minut w temperaturze 37 °C. Upewnić się, że transportowany jest minimalny bufor lub nie ma go wcale, stukając uchwytem w krawędź studzienki, aż w zbiorniku nie będzie nadmiaru buforu.
- W eksperymentach ze środkami farmakologicznymi, takimi jak inhibitory transportera monoamin, należy inkubować próbki tkanek z lekami rozcieńczonymi w utlenionym buforze wypływowym (np. 10 μM fluoksetyna, 40 μM kokaina; patrz ryc. 1B2). Ostateczna objętość w każdym dołku wyniesie 500 μl.
- Druga inkubacja
- Przenieść posiadacz wraz z tkanką do nowego zestawu studzienek zawierających 500 μl całkowitego buforu wypływu z pożądanym stężeniem każdego leku lub bez niego. Upewnij się, że nie pozostał nadmiar bufora. Każdy studzienek reprezentuje n = 1 dla warunków eksperymentalnych. Każdy warunek eksperymentalny przeprowadza się w trzech egzemplarzach.
- Jedna studzienka zawiera natleniony bufor wypływu, następna 10-30 μM AMPH, a ostatnia studzienka zawiera 10-30 μM AMPH plus inhibitory transportera monoamin. Każdy lek rozpuszcza się w utlenionym buforze wypływowym.
- Inkubować tkankę przez 20 minut w temperaturze 37 °C z 500 μl leku.
nuta: Dodatkowe studzienki mogą zawierać natleniony bufor wypływu o wysokiej zawartości K+ z inhibitorami transportera monoamin lub bez nich. Rozpuścić każdy lek w utlenionym buforze wypływowym (500 μl).
- Podczas tej drugiej inkubacji trwającej 20 minut, zebrać roztwór ze studzienek z pierwszej inkubacji w kroku 1.2.1 i przenieść do probówek do mikrowirówek zawierających 50 μl 1 N kwasu nadchlorowego lub kwasu fosforowego (w zależności od rodzaju HPLC, końcowe stężenie 0,1 N). Ostateczna objętość próbki wyniesie 550 μl. Utrzymuj probówki do mikrowirówek na lodzie i oznacz probówki #1.
- Po drugiej inkubacji trwającej 20 minut przenieść uchwyt na tkankę z wycinkami mózgu lub stemplami do pustej studzienki i utrzymać płytkę na lodzie. Przenieść sklarowany osad do probówek mikrowirówkowych zawierających 50 μl 1 N kwasu nadchlorowego lub kwasu fosforowego. Ostateczna objętość próbki wyniesie 550 μL. Utrzymuj probówki do mikrowirówek na lodzie i oznacz probówki #2.
- Dodać 1 ml lodowatego buforu do rozwarstwiania do każdej studzienki zawierającej tkankę. Zbierz całą tkankę za pomocą małej pęsety i przenieś do czystych probówek do mikrowirówek.
- Utrzymuj probówki z tkanką mózgową w temperaturze -80 °C. Wyrzuć 1 ml buforu do preparacji (ryc. 1B4).
- Roztwory filtracyjne otrzymane z każdej inkubacji za pomocą probówek filtracyjnych z mikrowirówki (0,22 μm) przy 2 500 x g przez 2 min. Użyć filtratu do oznaczenia zawartości monoamin za pomocą HPLC z detekcją elektrochemiczną (rysunek 1B5).
