Wszystkie opisane tutaj procedury na zwierzętach zostały zatwierdzone przez Icahn School of Medicine w Mount Sinai institutional core and use committee.
1. Przygotowanie przed izolacją komórek zaworu od dorosłych myszy
- Oczyść i wysterylizuj wszystkie narzędzia chirurgiczne pokazane na rysunku 1A, używając 70% v/v etanolu, a następnie sterylizuj je w autoklawie przez 30 minut. Wyczyść przestrzeń roboczą chirurgiczną 70% etanolem.
- Dodać 500 μl penicyliny-streptomycyny do 50 ml 10 mm HEPES. Przygotować podwielokrotność 50 ml 1x soli fizjologicznej buforowanej fosforanami (PBS). Utrzymuj roztwory na lodzie.
- Przygotuj roztwory kolagenazy o stężeniu 1 mg/ml i 4,5 mg/ml i użyj 5 ml każdego roztworu w probówkach o pojemności 15 ml do wykonania całej procedury. Aby przygotować 5 ml kolagenazy 1 mg/ml, zmieszaj 5 mg kolagenazy z 2,5 ml zmodyfikowanego podłoża Eagle Medium firmy Dulbecco (DMEM, wolna od płodowej surowicy bydlęcej (FBS)) i 2,5 ml 10 ml 10 mM HEPES uzupełnionych antybiotykami (1% penicylina-streptomycyna z kroku 1.2). Przefiltruj roztwory przez filtr 0,22 μm, aby usunąć wszelkie zanieczyszczenia.
UWAGA: Roztwory należy przechowywać na lodzie, aby chronić enzymy.
- Podgrzej roztwór DMEM do 37 °C przed użyciem we wszystkich krokach opisanych poniżej. Przygotować kompletną pożywkę, uzupełniając DMEM 1% penicyliny-streptomycyny, 1% pirogronianu sodu, 5 ml 200 mM L-glutaminy, 1 ml odczynnika do eliminacji mykoplazmy (patrz tabela materiałów) i 10% FBS.
2. Izolacja komórek zaworu
- Aby uzyskać 105 komórek do eksperymentu, użyj pięciu 8-tygodniowych myszy (minimum trzy). Umieść mysz w komorze indukcyjnej wraz z małym kawałkiem bibuły nasączonej 1 ml izofluranu, ale nie dopuszczaj do kontaktu z tkanką. Aby potwierdzić, że zwierzę jest w pełni znieczulone; Sprawdź, czy nie ma odruchu szczypania palców u stóp, a następnie poddaj mysz eutanazji przez zwichnięcie szyjki macicy. Stosować izofluran w celu złagodzenia bólu przed zwichnięciem szyjki macicy, ponieważ procedura opisana poniżej jest nieuleczalna.
- Umieść mysz na platformie preparacyjnej i przymocuj łapy kaniulami, aby utrzymać ją na miejscu. Oczyść klatkę piersiową i brzuch etanolem; Otwórz brzuch i klatkę piersiową nożyczkami. Małymi nożyczkami chirurgicznymi przeciąć między lewym przedsionkiem a lewą komorą, aby wykrwawić mysz. Perfuzję serca za pomocą 10 ml zimnego 1x PBS, aby usunąć krew z serca.
- Przeciąć serce i zachować 3 mm od aorty wstępującej, jak pokazano na rysunku 1B. Wypreparuj zastawkę aortalną pod mikroskopem stereoskopowym. Przeciąć serce poziomo na środku komór (ryc. 1C). Przeciąć lewą komorę w kierunku aorty i ostrożnie wypreparować zastawkę aortalną (ryc. 1D-F). Umieść zawory razem w małym naczyniu do hodowli tkankowych o średnicy 35 mm.
- Umyj izolowane zawory w naczyniu do hodowli komórkowych o średnicy 75 mm z 5 ml zimnego HEPES (10 mM) uzupełnionego antybiotykami (1% penicylina-streptomycyna) w celu usunięcia krwi (ryc. 2). Przygotuj dwie probówki kolagenazy o pojemności 15 ml 1 mg/ml i 4,5 mg/ml zgodnie z powyższym opisem w kroku 1.3.
nuta: Po rozbiorze manipuluj izolowanymi zaworami w sterylnym kapturze bezpieczeństwa biologicznego, aby zminimalizować zanieczyszczenie.
- Inkubować zawory w kolagenazie typu I (1 mg/mL) przez 30 minut w temperaturze 37 °C, ciągle wstrząsając (Rysunek 2). Odwirować probówkę przez 5 minut przy 150 × g, przemyć osad raz 2 ml HEPES (10 mM) i wirować przez 30 s z dużą prędkością. Wlej zawartość tej probówki do naczynia hodowlanego o średnicy 35 mm i ostrożnie przenieś fragmenty tkanki za pomocą cienkiej pęsety do nowej probówki.
nuta: Na tym etapie VIC nadal nie są oddzielone od tkanki, a osad zawiera kawałki tkanki. Aby uniknąć zanieczyszczenia komórkami śródbłonka, nie należy odwirowywać po wirowaniu w kroku 2.5.
- Inkubuj osad w probówce 15 ml z 5 ml kolagenazy typu I (4,5 mg/ml) w temperaturze 37 °C pod ciągłym mieszaniem przez 35 min. Ponownie zawiesić komórki za pomocą pipety o pojemności 1 ml, aby oddzielić komórki, i odwirować przy 150 × g przez 5 minut w temperaturze 4 °C.
- Odrzuć supernatant i ponownie zawieś osad w 2 ml pełnego DMEM. Wirować przy 150 × g przez 5 minut w temperaturze 4 °C. Powtórzyć ten krok dwukrotnie, aby oczyścić komórki.
nuta: Osad nadal będzie zawierał fragmenty tkanek.
- Ponownie zawiesić osad w 1 ml kompletnej pożywki i umieścić komórki w jednym dołku 6-dołkowego naczynia do hodowli komórek w minimalnej ilości podłoża, aby ułatwić ich przymocowanie do szalki hodowlanej. Pozostaw komórki w spokoju w inkubatorze o temperaturze 37 °C z 5% dwutlenkiem węgla.
- Po 3 dniach sprawdź komórki pod mikroskopem, aby sprawdzić prawidłowy wzrost w pobliżu resztek tkanki. Gdy 1,000 komórek będzie widocznych pod mikroskopem, ostrożnie usuń resztki tkanki za pomocą autoklawowanej pęsety i zmień pożywkę.
nuta: Płyta nie powinna być naruszona; Jeśli wymagana liczba komórek nie zostanie zaobserwowana, umieść naczynie do hodowli komórkowych z powrotem w inkubatorze na kolejne 2 dni.
- Gdy komórki zlewają się w 70% (2,5 × 105), trypsynizuj i przenieś je do naczynia do hodowli tkankowej o średnicy 75 mm.
3. Test zwapnienia in vitro
- Wyczyść okap 70% etanolem, ogrzej podłoże DMEM do 37 °C.
- Wysiewać 100 000 komórek/kondycję na 6-dołkowe płytki w kompletnym DMEM i hodować przez 24 godziny w temperaturze 37 °C.
- Przygotować pożywkę wapniącą, mieszając 2 mM NaH2PO4, 10-7 M insuliny i 50 μg/ml kwasu askorbinowego w DMEM z 5% FBS. Na 93 ml DMEM dodać 5 ml FBS, 1 ml antybiotyków (końcowe stężenie 1%), 1 ml pirogronianu sodu (100 mM), 27,5 mg NaH2PO4, 5,8 μl insuliny i 5 mg kwasu askorbinowego.
UWAGA: Przed użyciem przefiltrować roztwór za pomocą filtra 0,22 μm.
- Po 24 godzinach zastąp pożywkę sklarowaną pożywką wapniącą. Inkubować komórki przez 7 dni w temperaturze 37 °C. W 3 dniu należy zastąpić je świeżą pożywką wapniącą i umieścić płytkę z powrotem w inkubatorze, aby zakończyć 7-dniowe leczenie.
- Po 7 dniach usuń pożywkę i umyj komórki dwukrotnie 2 ml 1x PBS. Inkubować komórki w 1 ml 0,6 N kwasu solnego (HCl) przez 24 godziny w temperaturze 37 °C. Zebrać HCl do probówki o pojemności 1,5 ml i odparować w wyparce obrotowej. Ponownie zawiesić zawartość wszystkich probówek w 60 μl HCl.
nuta: Procedura suszenia jest ważna, aby stężyć roztwór i uzyskać taką samą objętość dla każdego stanu.
- Użyj płytki 96-dołkowej do pomiaru stężenia wapnia za pomocą odczynnika Arsenazo III, dostępnego w gotowym do użycia zestawie (zobacz Tabelę Materiałów, aby uzyskać więcej informacji).
- Przygotuj roztwór wzorcowy wapnia o stężeniu 10 mg/dl. Odważyć 10 mg wodorotlenku wapnia (Ca(OH)2) i rozpuścić w 100 ml wody destylowanej.
- Na przezroczystej 96-dołkowej płytce odpipetuj 2 μL ślepego roztworu (HCl, 0,6 N), roztwór wzorcowy, próbkę na studzienkę (10 mg/dl) i próbki. Przeprowadzić doświadczenie w trzech egzemplarzach, aby sprawdzić zmienność pipetowania. Dodać 200 μl odczynnika dla każdego warunku.
nuta: Próbki o stężeniu powyżej 15 mg/dl należy rozcieńczyć solą fizjologiczną w stosunku 1:1, ponownie oznaczyć, a wynik pomnożyć przez dwa.
- Inkubuj reakcję przez 15 minut w temperaturze pokojowej.
nuta: Reakcja jest stabilna przez 60 minut.
- Odczyt i zapis absorbancji płytki przy 650 nm. Aby obliczyć ilość wapnia w próbkach, należy użyć następującego wzoru:
Wapń (mg/ml) = (absorbancja próbki/absorbancja wzorca) × Stężenie wzorca
