Test immunofluorescencyjny do wykrywania uszkodzeń DNA za pośrednictwem PM2,5 w zarodkach ryb

Streszczenie

Źródło: Huang, Y., et al. Używanie immunofluorescencji do wykrywania uszkodzeń DNA wywołanych PM_2,5 w sercach zarodków danio pręgowanego. J. Vis. Exp. (2021).

Ten film demonstruje bardzo czuły test oparty na immunofluorescencji do wykrywania uszkodzeń oksydacyjnych wywołanych PM_2.5 w sercach zarodków danio pręgowanego poprzez pomiar poziomów 8-OHdG i γH2AX, które wskazują odpowiednio na uszkodzenie DNA i pęknięcia dwuniciowego DNA.

Protokół

Wszystkie procedury dotyczące modeli zwierzęcych zostały sprawdzone przez lokalny instytucjonalny komitet opieki nad zwierzętami oraz weterynaryjną komisję rewizyjną JoVE.

1. Pobieranie próbek PM_2,5 i ekstrakcja związków organicznych

UWAGA: PM_2.5 został zebrany w obszarze miejskim w Suzhou w Chinach w dniach 1-7 sierpnia 2015 roku, jak opisano wcześniej.

1. Piecz filtry z membraną kwarcową o średnicy 47 mm w piecu muflowym o temperaturze 500 °C przez 2 godziny, aby usunąć składniki organiczne.
2. Umieścić filtr w próbniku PM_2,5 na 24 godziny nieprzerwanego pobierania próbek.
3. Wyjmij filtr i susz przez 24 godziny w temperaturze pokojowej.
4. Określ ilościowo filtr za pomocą wagi analitycznej.
5. Ekstrahować składniki organiczne z filtra przez ekstrakcję Soxhleta przy użyciu dichlorometanu jako rozpuszczalnika.
6. Wysuszyć EOM przez obrotowe odparowanie w łaźni wodnej o temperaturze 60 °C i przepływ azotu. Rozpuścić EOM w DMSO i przechowywać w temperaturze -20 °C.

2. Pobieranie i leczenie zarodków danio pręgowanego

1. Utrzymać danio pręgowanego w temperaturze 28,5 ± 0,5 °C w systemie akwakultury z recyrkulacyjnym cyklem fotoperiodycznym trwającym 14 godzin w świetle i 10 godzin.
2. Umieść zdrowego dorosłego danio pręgowanego w zbiorniku w stosunku 2: 1 samca do samicy.
3. Następnego dnia zbierz zarodki i umyj je wodą systemową (tj. wodą hodowlaną danio pręgowanego).
4. Wybierz i losowo podziel zarodki danio pręgowanego wykazujące prawidłowy rozwój (jednolita wielkość, pełne ziarna i brak krzepnięcia jaj) na 4 grupy na indywidualnych szklanych szalkach Petriego o średnicy 7 cm (około 50 zarodków na szalkę).
5. Traktować zarodki PM_2,5 (5 mg/l) w obecności lub bez NAC w stężeniu 0,25 μM od 2 hpf do 72 hpf. Stosować DMSO jako kontrolę nośnika do końcowego stężenia 0,1% (v/v).

3. Obserwacja morfologiczna zarodków danio pręgowanego i sekcja serca

1. Przy 72 hpf przenieś zarodki do szklanych szkiełek i obserwuj pod mikroskopem stereoskopowym. Rejestruj wady rozwojowe serca, takie jak obrzęk osierdzia, zmienione pętle i zmniejszony rozmiar.
2. Oblicz wskaźniki wad rozwojowych (odsetek zarodków z wadami serca w stosunku do wszystkich żyjących zarodków) i przeanalizuj różnice między grupami za pomocą jednoczynnikowej ANOVA, a następnie tureckiego testu wielokrotnego porównania (p < 0,05 = statystycznie istotne).
3. Znieczulić zarodki 0,6 mg/ml MS-222 w celu unieruchomienia ich na szkiełkach podstawowych.
4. Rejestruj bicie serca przez 30 s i określaj ilościowo tętno za pomocą oprogramowania ImageJ.
5. Wypreparuj serca z zarodków danio pręgowanego za pomocą jednorazowej igły strzykawkowej pod mikroskopem stereoskopowym. Uwaga: Unikaj niszczenia kształtu serca.

4. Test immunofluorescencyjny

1. Aby użyć testu immunofluorescencyjnego do wykrycia uszkodzenia DNA wywołanego PM_2,5 w sercu zarodków danio pręgowanego, użyj hydrofobowego pisaka barierowego, aby narysować okrąg na czystej szklanej stronie.
2. Dodaj 50 μl 4% paraformaldehydu do 1,25 ml soli fizjologicznej buforowanej fosforanami (PBS), aby uzyskać roztwór utrwalający.
3. Umieść 3 wypreparowane serca w jednym hydrofobowym okręgu barierowym i inkubuj przez 20 minut w temperaturze pokojowej.
4. Zdekantować roztwór pod mikroskopem i suszyć próbki w temperaturze pokojowej przez co najmniej 5 minut, tak aby serca całkowicie przylegały do szkiełek podstawowych.
5. Umyj szkiełka trzy razy w PBS z 0,1% Tween 20 (PBST) przez 5 minut na pranie.
6. Dodać 50 μl albuminy surowicy bydlęcej (BSA) do 1000 μl PBST, aby otrzymać 5% roztwór BSA i inkubować szkiełka w wilgotnej komorze przez 1 godzinę w celu zablokowania niespecyficznego wiązania przeciwciał.
7. Zdekantować roztwór i przemyć próbki trzykrotnie PBST przez 5 minut na przemycie.
8. Rozcieńczyć 2 μl mysiego przeciwciała monoklonalnego przeciwko 8-OHdG i 2 μl króliczego przeciwciała poliklonalnego przeciwko γH2AX w 296 μl PBST, aby otrzymać działający pierwszorzędowy roztwór koktajlu przeciwciał.
9. Próbki serca inkubować z 50 μl pierwszorzędowego roztworu koktajlu przeciwciał przeciwko 8-OHdG i γH2AX w wilgotnej komorze przez co najmniej godzinę w temperaturze pokojowej lub przez noc w temperaturze 4 °C (inkubacja przez noc może zwiększyć intensywność sygnału).
10. Zdekantować roztwór i przemyć próbki trzykrotnie PBST przez 5 minut na przemycie.
11. Rozcieńczyć 1 μl znakowanego FITC koziego przeciwciała anty-mysiego i 1 μl koziego przeciwciała wtórnego przeciwko królikowi cy3 w 498 μl PBST w celu otrzymania działającego roztworu koktajlu przeciwciał drugorzędowych i inkubować próbki z przeciwciałami drugorzędowymi (1:500 w PBST) przez 1 godzinę w temperaturze pokojowej w ciemności.
12. Zdekantować roztwór i przemyć próbki trzykrotnie PBS przez 5 minut na płukanie, chroniąc je przed światłem.
13. Dodać 20 μl DAPI (4',6-diamidino-2-fenyloindol) do próbek w celu barwienia jądrowego przez 30 minut w temperaturze pokojowej.
14. Nałóż szkiełko nakrywkowe, aby przesunąć i uszczelnić lakierem do paznokci, aby zapobiec wysuszeniu i przemieszczaniu się. Następnie zobrazuj próbki pod mikroskopem fluorescencyjnym i określ ilościowo sygnał fluorescencyjny obszaru serca za pomocą oprogramowania ImageJ. Obliczyć względne zmiany za pomocą średniej próbek kontrolnych DMSO. Określ istotność statystyczną danych jak w kroku 3.2.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
Przeciwciało 8-OHdG	Santa Cruz Biotechnology, Stany Zjednoczone	SC-66036	Przeciwciało pierwszorzędowe
Waga analityczna	Sartorius, Chiny	BSA124S
Bsa	Solarbio, Pekin, Chiny	Zobacz materiał SW3015	Do blokowania
DAPI (interfejs DAPI)	Abcam, Stany Zjednoczone Ameryki	ab104139	Do przeciwbarwienia jądrowego.
Dmso	Solarbio, Pekin, Chiny	Zobacz materiał D8371
Mikroskop fluorescencyjny	Olympus, Japonia	Zobacz materiał IX73	Do obrazowania sygnałów fluorescencyjnych
Kozia Anty-Królicza IgG Cy3	Karlowe Wary, Stany Zjednoczone	Zobacz materiał CW0159	Przeciwciało drugorzędowe
Kozia IgG Anty-Królicza FITC	Karlowe Wary, Stany Zjednoczone	Przekaźnik RS0003	Przeciwciało drugorzędowe
N-acetylo-L-cysteina (NAC)	Adamas-Beta, Szanghaj, Chińska Republika Ludowa	616-91-1
Wytrząsarka orbitalna	QILINBEIER, Chiny	TS-1
Paraformaldehyd	Sigma, Chiny	Zobacz materiał P6148	Przygotuj 4% paraformaldehydu do utrwalenia.
sól fizjologiczna buforowana fosforanami	HyClone, Stany Zjednoczone	SH30256.01	Przygotuj 0,1% Tween w PBS do prania.
Próbnik PM2,5	TianHong, Wuhan, Chiny	TH-150C	Do 24-godzinnego nieprzerwanego pobierania próbek PM2,5.
System akwakultury z recyrkulacją	HaiSheng, Szanghaj, Chiny		Trzymano w nim danio pręgowanego.
Ekstraktor Soxhleta	ZhengQiao, Szanghaj, Chiny	Zobacz materiał BSXT-02	Do ekstrakcji składników organicznych.
Mikroskop stereoskopowy	Nikon, Kanada	Zobacz materiał SMZ645	Do wycinki serca z zarodków danio pręgowanego.
Metanosulfonian trikainy (MS222)	Sigma, Chiny	E10521	Do znieczulania zarodków danio pręgowanego
Animacja 20	Sigma, Chiny	Zobacz materiał P1379
Przeciwciało γH2AX	Abcam, Stany Zjednoczone Ameryki	ab26350	Przeciwciało pierwszorzędowe

powiedział: powiedział: powiedział: powiedział: powiedział: powiedział: