$$\rightleftharpoonup{xx}$$
$$\longleftharp{xx}$$,
$$\longrightharp{xx}$$,
Wszystkie procedury dotyczące modeli zwierzęcych zostały sprawdzone przez lokalny instytucjonalny komitet opieki nad zwierzętami oraz weterynaryjną komisję rewizyjną JoVE.
1. Przygotowanie plastrów kory nosowej i hipokampa
UWAGA: Do przygotowania wycinków kory nosowej i hipokampa używa się szczurów P6-7 Sprague-Dawley.
- Konfiguracja kultury i przygotowanie podłoża
- W dniu poprzedzającym hodowlę należy przygotować wymagane podłoża i umieścić je w temperaturze 4 °C.
- Przygotuj pożywkę preparacyjną: 25 mM glukozy w zrównoważonym roztworze soli Geya (GBSS).
- Przygotuj pożywkę: 50% Opti-MEM, 25% HBSS, 25% surowica końska (HS), 25 mM glukozy, 30 μg/ml Gentamycyny.
- Przygotuj pożywkę podtrzymującą: Neurobaseal-A (NBA), 2% B27, 1 mM L-glutaminy, 30 μg/ml Gentamycyny, HS (15%, 10%, 5% i 0%).
- Pobieranie mózgów
- Tuż przed rozpoczęciem hodowli dodać 1,1 ml pożywki do każdego dołka płytki 6-dołkowej za pomocą pipety P1000 i umieścić ją w temperaturze 37 °C.
- Umieść cały sprzęt (mikroskop preparacyjny, rozdrabniacz tkanek, lampę sekcyjną, narzędzia preparacyjne, elektrody, płytki, wkładki i bibuły filtracyjne) w komorze bezpieczeństwa biologicznego i sterylizuj w świetle UV przez 15 minut.
- Dostosuj grubość plastra do 350 μm.
- Wyjmij GBSS z lodówki. Dodaj 5 ml GBSS do sześciu szalek Petriego. Na jedno zwierzę przypada sześć szalek Petriego.
- Poddaj eutanazji szczeniaka szczura. Wykonaj dekapitację za pomocą ostrych nożyczek u podstawy pnia mózgu zwierzęcia.
- Umyj głowę zwierzęcia trzy razy w zimnym GBSS i zabierz ją do szafki bezpieczeństwa.
- Izolacja tkanek i przygotowanie plastrów
- Mocno włóż ostre kleszcze do oczodołów, aby przytrzymać głowę.
- Cienkimi nożyczkami przetnij skórę/skórę głowy wzdłuż linii środkowej, zaczynając od otworu kręgowego w kierunku płatów czołowych i odłóż na bok.
- Przeciąć w ten sam sposób czaszkę i wzdłuż poprzecznej szczeliny mózgowej (przestrzeń między mózgiem a móżdżkiem). Za pomocą zakrzywionych długich kleszczy rozsuń go.
- Wyrzuć opuszki węchowe szpatułką. Usuń mózg z głowy i umieść go w lodowatym GBSS z powierzchnią grzbietową skierowaną do góry (ryc. 1A).
- Włóż cienkie kleszcze do móżdżku i idź wzdłuż linii środkowej, a szpatułka bardzo ostrożnie otwiera każdą półkulę (ryc. 1B).
- Za pomocą kleszczyków o krótkiej krzywiźnie ostrożnie usuń nadmiar tkanki pokrywającej hipokamp, nie dotykając struktury hipokampa. Następnie za pomocą szpatułki przeciąć poniżej każdego hipokampa (ryc. 1C).
- Podnieś jedną półkulę i umieść ją hipokampem skierowanym do góry na bibule filtracyjnej. Powtórz procedurę z drugą półkulą i umieść ją równolegle do pierwszej, w bibule filtracyjnej. Połóż bibułę filtracyjną na rozdrabniaczu tkanek, tak aby półkule były prostopadłe do ostrza, i pokrój półkule na plasterki o grubości 350 μm (ryc. 1D).
- Umieść pokrojoną tkankę na szalce Petriego z zimnym GBSS (ryc. 1E).
- Ostrożnie oddziel plastry za pomocą elektrod z okrągłą końcówką (Rysunek 1F). Zachowaj tylko plastry z nienaruszoną strukturalnie korą nosa i hipokampem. Obszary DG i CA powinny być idealnie zdefiniowane, podobnie jak kora śródwęchowa i okołęchowa (ryc. 1G).
- Umieść każdy plasterek na wkładce (Rysunek 1H-I) za pomocą szpatułki i elektrody z okrągłą końcówką. Usuń nadmiar pożywki preparacyjnej wokół każdej plastry za pomocą pipety P20 (Rysunek 1J). Cztery wycinki kory nosowej i hipokampa można hodować w jednej wkładce (ryc. 1K).
- Utrzymanie kultury
- Zmieniaj podłoże co drugi dzień.
- Rozgrzać podłoże w temperaturze 37 °C.
- Wyjmij płytki z inkubatora. Podnieś każdą wkładkę, przytrzymując plastikową krawędź kleszczami (Rysunek 1L).
- Użyj wolnej ręki, aby zassać podłoże ze studni. Umieścić wkładkę z powrotem w studzience i dodać 1 ml za pomocą pipety P1000 świeżo podgrzanego podłoża (ryc. 1M). Powtórz tę czynność dla wszystkich wkładek. Upewnij się, że między membraną a medium nie są uwięzione pęcherzyki powietrza.
nuta: Plastry podobne do epilepsji ulegają stopniowemu i kontrolowanemu pozbawianiu surowicy w pożywce. Począwszy od 9 Days In Vitro (DIV), slices są utrzymywane w NBA bez HS.
2. Zapisy elektrofizjologiczne
UWAGA: Zapisy elektrofizjologiczne zostały wykonane w organotypowych warstwach kory nosowej i hipokampa na 7, 14 i 21 DIV w komorze typu interfejsowego. Nagrania uzyskano za pomocą wzmacniacza, zdigitalizowano i przeanalizowano za pomocą oprogramowania. Wszystkie nagrania były filtrowane pasmowo-przepustowo (ośmiobiegunowy filtr Bessela przy 60 Hz i filtr Gaussa przy 600 Hz).
- Przygotowanie do konfiguracji
- Przygotuj 50 ml pożywki NBA z 1 ml witaminy B27 i 250 μl L-glutaminy. Rozgrzać się w temperaturze 37 °C.
- Ustaw konfigurację elektrofizjologii w obiegu zamkniętym. Sprawdź, czy natężenie przepływu wynosi 2 ml/min.
- Otwórz zawór skrzyni ładunkowej (5% CO2/95% O2) i sprawdź poziom wody w układzie.
- Umieść bibułę filtracyjną w komorze zapisu interfejsu, aby spuścić nadmiar medium, a bibułę do czyszczenia obiektywu pod ramką, aby dostarczyć medium do plasterka.
- Włącz regulator temperatury, wzmacniacze i mikromanipulator.
- Poczekaj, aż temperatura w komorze interfejsu ustabilizuje się na poziomie 37 °C przed rozpoczęciem zapisów.
- Przygotować sztuczny płyn mózgowo-rdzeniowy (aCSF: 124 mM NaCl, 3mM KCl, 1,2 mM NaH2PO4, 25 mM NaHCO3, 10 mM glukozy, 2 mM CaCl2, 1 mMMgSO4 o pH 7,4) i użyć go do napełnienia szklanej elektrody za pomocą strzykawki. Umieść go w elektrodzie odbiorczej.
- Nagrania spontanicznej aktywności
- Gdy temperatura się ustabilizuje, wyjmij płytkę z inkubatora i odetnij jeden plasterek z wkładki bardzo ostrym ostrzem. Umieść go w talerzu o średnicy 60 mm z kroplą pożywki. Zabierz go do komory nagrywania interfejsu.
- Umieść plasterek w komorze interfejsu z hipokampem w prawym dolnym rogu. Umieść elektrodę odbiorczą w warstwie ogniwa piramidalnego CA3.
- Przejdź do protokołu ciągłej akwizycji i nagrywaj przez 30 minut.
