Test agregacji PolyQ w celu identyfikacji neuroprotekcyjnego działania związku u robaków

Streszczenie

Źródło: Wang, Q. et al. Caenorhabditis elegans jako modelowy system do odkrywania związków bioaktywnych przeciwko neurotoksyczności za pośrednictwem poliglutaminy. J. Vis. Exp. (2021)

Ten film opisuje metodę in vivo do badania potencjału ochronnego neuroprotekcyjnych związków testowych w zmniejszaniu agregacji polyQ w komórkach mięśniowych ścian ciała nicieni i łagodzeniu proteotoksyczności związanej z agregacją.

Protokół

1. Test agregacji PolyQ

1. Przygotowanie nicieni do testu agregacji polyQ
   1. Przenieść 300-500 zsynchronizowanych larw L1 AM141 do każdej studzienki 48-dołkowej płytki z 500 μl pożywki S zawierającej OP50 (OD₅₇₀ 0,7-0,8) i 5 mg/ml astragalanu, zwykle po jednej studzience na zabieg przez jeden punkt czasowy.
   2. Uszczelnić płytkę parafilmem i inkubować w temperaturze 20 °C i 120 obr./min przez 24, 48, 72 i 96 godzin.
   3. Zebrać nicienie w sterylnej probówce do mikrowirówek o pojemności 1,5 ml i przemyć buforem M9 >3 razy przez odwirowanie (1000 × g przez 1 minutę) w celu usunięcia pozostałego OP50. Ponownie zawieś nicienie AM141 w buforze M9 i utrzymuj je w gotowości do akwizycji obrazu.
2. Akwizycja obrazów fluorescencyjnych i analiza danych
   UWAGA: Dane są automatycznie analizowane za pomocą tego systemu obrazowania o wysokiej zawartości. Jeśli automatyczne urządzenie do obrazowania nie jest dostępne, można zastosować konwencjonalną metodę przygotowania podkładki agarozowej do akwizycji obrazu, aby osiągnąć podobną wydajność przy użyciu zwykłego mikroskopu fluorescencyjnego.
   1. Przenieść 10-15 nicieni do każdej studzienki na płytce 384-dołkowej (końcowa objętość 80 μl na studzienkę). Ustaw 10 powtórzonych studzienek dla każdego zabiegu.
   2. Dodaj 10 μl 200 mM azydku sodu do każdej studzienki, aby sparaliżować nicienie i pozwolić im osiąść na dnie (5-10 min).
   3. Umieść płytkę w systemie obrazowania o wysokiej zawartości, aby uzyskać obrazy fluorescencyjne (informacje o urządzeniu i oprogramowaniu znajdują się w Tabeli materiałów).
   4. Otwórz oprogramowanie do akwizycji obrazów i skonfiguruj następujące parametry.
      1. Otwórz okno Ustawienia akwizycji płyt i utwórz nowy zestaw eksperymentów oraz nazwę.
      2. Wybierz Powiększenie jako 2x, Kamera w binning jako 1 i Typ płytki jako Płytka 384-dołkowa.
      3. Ustaw studnie i miejsca (pojedyncze miejsce), które mają być odwiedzane.
      4. Wybierz filtr izotiocyjanianu fluoresceiny (FITC) i włącz opcje ustawiania ostrości na podstawie obrazu.
      5. Ustaw ekspozycję na 300 ms.
         nuta: Powyższe ustawienia można przetestować i dostosować w celu optymalizacji parametrów obrazowania.
      6. Zapisz ustawienia pobierania obrazu i kliknij przycisk Pobierz płytę, aby uruchomić.
   5. Analizuj dane obrazu za pomocą oprogramowania do analizy obrazu.
      1. Otwórz okno Review Plate Data (Dane płytki przeglądowej) i wybierz Płytkę testową do analizy obrazu.
      2. Kliknij dwukrotnie studzienkę testową, aby wyświetlić jej obraz.
      3. Wybierz metodę analizy Count Nuclei i kliknij przycisk Konfiguruj ustawienia, aby wyświetlić okno z następującymi ustawieniami.
      4. Zdefiniuj obraz źródłowy z kanału FITC i wybierz algorytm standardowy.
      5. Ustaw parametry analizy obrazu w następujący sposób: przybliżona minimalna szerokość = 10 μm (= 2 piksele); przybliżona maksymalna szerokość = 50 μm (= 12 pikseli); intensywność powyżej lokalnego tła = 1,000-2,000 poziomów szarości.
      6. Przetestuj bieżące ustawienia, aby zoptymalizować metodę analizy.
      7. Zapisz ustawienia i uruchom analizę na wszystkich odwiertach.
         nuta: Zakończenie analizy dla jednej płytki 384-dołkowej zajmuje ~20 minut.
      8. Wyeksportuj łączną liczbę jąder jako całkowitą liczbę agregatów Q40::YFP w każdym dołku.
   6. Policz liczbę nicieni w każdym dołku.
   7. Oblicz średnią liczbę agregatów Q40::YFP na nicienie w każdej grupie i zastosuj nieliniowe dopasowanie krzywej do danych z każdego punktu czasowego.
   8. Oblicz wskaźnik hamowania:
      Wskaźnik inhibicji = (_{N kontrola} - N_próbki) / Ncontrol
      Gdzie_{N kontrolna} i_{N próbka} są średnią liczbą agregatów Q40::YFP odpowiednio w grupie kontrolnej i badanej.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
Szczep C. elegans
AM141 rmIs133 [unc-54p::Q40::YFP]	Centrum Genetyki Caenorhabditis (CGC)		https://cgc.umn.edu/strain/AM141
Szczep E. coli
Zobacz materiał OP50	Centrum Genetyki Caenorhabditis (CGC)		https://cgc.umn.edu/strain/OP50
Odczynnik
Azydek sodu	Sinopharm Chemical Reagent Co., Sp. z o.o.	80115560	https://www.reagent.com.cn/goodsDetail/5e981aa807664e26af 551E96FF5F07CD
sprzęt
384-dołkowa płytka do hodowli komórkowej	Nest Biotechnology Co., Sp. z o.o.	761001	https://www.cell-nest.com/page94? _l=en&product_id=85
48-dołkowa płytka do hodowli komórkowej	Nest Biotechnology Co., Sp. z o.o.	748001	https://www.cell-nest.com/page94? _l=en&product_id=85
Mikroskop fluorescencyjny	Guangzhou Micro-shot Optical Technology Co., Ltd.	Mshot MF31-LED	https://www.mshot.com/ article/442.html
System obrazowania o wysokiej zawartości	Urządzenia molekularne	ImageXpress (Drukarka ImageXpress)	https://www.moleculardevices.com/ produkty/komórkowe-systemy obrazowania#High-Content-Imaging
Mikrowirówka	Firma GeneCompany	GENESPEED X1	https://www.genecompany.com/ index.php/Strona główna/Towary/ goodsdetails/gid/189.html
Parafilm M	Sigma-Aldrich	Zobacz materiał P7793-1EA	https://www.sigmaaldrich.cn/CN/en/product/sigma/p7793?context=product
Mikroskopowa kamera cyfrowa	Guangzhou Micro-shot Optical Technology Co., Ltd.	Magazyn MS60	https://www.mshot.com/article/677.html
oprogramowanie
Oprogramowanie do akwizycji i analizy obrazów	Urządzenia molekularne	MetaXpress (Biblioteka MetaXpress)	Produkty https://www.moleculardevices.com//systemy-obrazowania-komórkowego/ oprogramowanie-do-analizy-akwizycji/metaxpress