Test do badania wpływu badanego związku na neurotoksyczność za pośrednictwem PolyQ u robaków

Streszczenie

Źródło: Wang, Q. et al., Caenorhabditis elegans jako modelowy system do odkrywania związków bioaktywnych przeciwko neurotoksyczności za pośrednictwem poliglutaminy. J. Vis. Exp. (2021)

W tym filmie opisujemy metodę oceny neuroprotekcyjnego wpływu badanego związku, astragananu, na przeżycie neuronów u Caenorhabditis elegans z powodu neurotoksyczności za pośrednictwem polyQ. W teście wykorzystuje się Caenorhabditis elegans wykazujące ekspresję nieprawidłowo ekspandowanych powtórzeń polyQ połączonych z GFP w ich neuronach ASH w celu pomiaru przeżycia neuronów po leczeniu badanym związkiem.

Protokół

1. Test neurotoksyczności za pośrednictwem PolyQ

1. Leczenie C. elegans próbkami do badań
   1. Aby przygotować nicienie do testu neurotoksyczności polyQ, przenieś 300-500 zsynchronizowanych larw L1 HA759 do każdej studzienki 48-dołkowej płytki z 500 μl pożywki S zawierającej OP50 (OD₅₇₀ 0,7-0,8) i 5 mg / ml astragalanu; zwykle trzy powtórzone dołki dla każdego zabiegu.
   2. Uszczelnić płytkę parafilmem i inkubować w temperaturze 15 °C i 120 obr./min przez 3 dni.
   3. Zebrać nicienie przez odwirowanie i przemyć 3-5 razy buforem M9. Ponownie zawiesić nicienie w buforze M9 do wykorzystania w testach przeżycia i unikania neuronów.
2. Przygotowanie podkładki agarozowej
   1. Dodać 2 g agarozy do 100 ml buforu M9 (2% m/v) i podgrzać roztwór agarozy w kuchence mikrofalowej do temperatury bliskiej wrzenia.
   2. Dozuj 0,5 ml stopionej agarozy na środek szkiełka mikroskopowego o grubości 1 mm umieszczonego między dwoma kawałkami szklanych płytek o grubości 2 mm. Przykryj kolejnym slajdem w pionie. Gdy agaroza ostygnie i zastygnie, delikatnie zdejmij górne szkiełko.
3. Test przeżycia neuronów ASH
   1. Dodaj kroplę 20 mM azydku sodu na podkładkę agarozową. Przenieś 15-20 nicieni HA759 do kropli, aby je unieruchomić.
   2. Delikatnie nałóż szkiełko nakrywkowe na nicienie. Szkiełko należy przechowywać pod mikroskopem fluorescencyjnym wyposażonym w kamerę cyfrową. Wybierz soczewkę obiektywu 40x i filtr FITC, aby wykryć neurony ASH GFP-dodatnie w obszarze głowy nicieni.
   3. Wybierz losowo ponad 50 nicieni w każdej grupie, aby policzyć liczbę nicieni z obustronnymi neuronami ASH znakowanymi GFP w regionie głowy. Oblicz wskaźnik przeżycia neuronów ASH:
      Przeżycie neuronalne (%) =
      Gdzie_przeżycie N i N_ogółem to odpowiednio liczba nicieni z neuronami ASH dodatnimi dla GFP i całkowita liczba badanych nicieni w każdej grupie.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
Szczep C. elegans
HA759 rtIs11 [osm-10p::GFP + osm-10p::HtnQ150 + dpy-20(+)]	Centrum Genetyki Caenorhabditis (CGC)		https://cgc.umn.edu/strain/HA759
Szczep E. coli
Zobacz materiał OP50	Centrum Genetyki Caenorhabditis (CGC)		https://cgc.umn.edu/strain/OP50
Odczynnik
Agarozy	Biowest (Zachód Biologi	Numer katalogowy: 111860
Azydek sodu	Sinopharm Chemical Reagent Co., Sp. z o.o.	80115560	https://www.reagent.com.cn/goodsDetail/5e981aa807664e26af 551E96FF5F07CD
sprzęt
48-dołkowa płytka do hodowli komórkowej	Nest Biotechnology Co., Sp. z o.o.	748001	https://www.cell-nest.com/page94?_l=en&product_id=85
Mikroskop fluorescencyjny	Guangzhou Micro-shot Optical Technology Co., Ltd.	Mshot MF31-LED	https://www.mshot.com/article/442.html
System obrazowania o wysokiej zawartości	Urządzenia molekularne	ImageXpress Pico	https://www.moleculardevices.com/products/cellular-imaging-systems#High-Content-Imaging
Mikrowirówka	Firma GeneCompany	GENESPEED X1	https://www.genecompany.com/index.php/Home/Goods/goodsdetails/gid/189.html
Mikroskopowa kamera cyfrowa	Guangzhou Micro-shot Optical Technology Co., Ltd.	Magazyn MS60	https://www.mshot.com/article/677.html
kuchenka mikrofalowa	Midea Corp.	M1-211A	https://www.midea.cn/10000/10000000001
Parafilm M	Sigma-Aldrich	Zobacz materiał P7793-1EA	https://www.sigmaaldrich.cn/CN/en/product/sigma/p7793?context=product
oprogramowanie
Oprogramowanie do akwizycji i analizy obrazów	Urządzenia molekularne	MetaXpress (Biblioteka MetaXpress)	Produkty https://www.moleculardevices.com//systemy-obrazowania-komórkowego/ oprogramowanie-do-analizy-akwizycji/metaxpress