Zbadaj zachowanie chemounikania u robaków transgenicznych za pomocą testu unikania osmotycznego

Abstract

Źródło: Wang, Q. et al., Z. Caenorhabditis elegans jako modelowy system do odkrywania związków bioaktywnych przeciwko neurotoksyczności za pośrednictwem poliglutaminy. J. Vis. Exp. (2021).

Ten film opisuje test unikania osmotycznego w celu zbadania zachowania chemounikania w modelu transgenicznego robaka. Zachowanie unikania jest testowane na płytce w obecności bariery o wysokiej zawartości osmotycznej i chemoatraktantu. Robaki z funkcjonalną utratą neuronów zostają przyciągnięte przez chemoatraktant, przekraczają barierę wysokoosmotyczną i zostają sparaliżowane w strefie pułapki z powodu roztworu znieczulającego.

Protocol

Wszystkie procedury dotyczące modeli zwierzęcych zostały sprawdzone przez lokalny instytucjonalny komitet opieki nad zwierzętami oraz weterynaryjną komisję rewizyjną JoVE.

UWAGA: Zobacz Tabelę 1, aby zapoznać się z recepturami rozwiązań używanych w tym protokole.

1. Przygotowanie materiałów do testu Caenorhabditis elegans

1. Utrzymanie szczepów C. elegans
   1. Otrzymać szczepy C. elegans (AM141 i HA759) i Escherichia coli (OP50 i NA22) (patrz tabela materiałów).
   2. Utrzymywać nicienie na pożywce wzrostowej nicieni (NGM) wysiane E. coli OP50 w temperaturze 20 °C dla AM141 lub 15 °C dla HA759.
2. Przygotowanie kultury bakterii E. coli OP50
   1. Wybierz pojedynczą kolonię E. coli OP50 z płytki smugowej Luria-Bertani (LB) i zaszczep ją w 50 ml płynnej kultury LB.
   2. Inkubować bakterie OP50 w wytrząsarce w temperaturze 37 °C i 200 obr./min do uzyskania gęstości optycznej ~0,5 przy 570 nm (OD₅₇₀).
   3. Przechowuj kulturę bakterii OP50 w temperaturze 4 °C i zużyj ją w ciągu dwóch tygodni.
3. Przygotowanie płytek NGM z bakteriami OP50
   1. Dodaj 20 g agaru, 2,5 g peptonu, 3,0 g NaCl i 975 ml wody dejonizowanej do butelki o pojemności 1 l. Autoklaw w temperaturze 121 °C przez 30 min.
   2. Umieść płynną butelkę agarową NGM na stole, aby ostygła do ~60 °C, a następnie dodaj następujące sterylne roztwory podstawowe: 1 ml 1 M CaCl₂, 1 ml 1 M MgSO₄, 1 ml 5 mg / ml cholesterolu i 25 ml 1 M fosforanu potasu (pH 6,0).
   3. Wlej 20 ml NGM do sterylnej szalki Petriego o średnicy 90 mm i pozostaw płytki na stole do ostygnięcia i zestalenia. Trzymaj talerze do góry nogami i pozwól im wyschnąć na ławce w temperaturze pokojowej przez 2 dni.
   4. Dozować 200 μl kultury bakterii OP50 na każdą płytkę NGM i równomiernie rozprowadzić za pomocą sterylnej pałeczki do powlekania szkłem. Zamknąć pokrywki i inkubować płytki przez noc w temperaturze 37 °C.
   5. Przechowuj płytki NGM wysiane OP50 w plastikowym pudełku z pokrywką w temperaturze pokojowej i zużyj w ciągu dwóch tygodni.
4. Przygotowanie populacji C. elegans zsynchronizowanej z wiekiem
   1. Zebrać grawitacyjne dorosłe nicienie do sterylnej probówki mikrowirówkowej o pojemności 1,5 ml i odwirować przy 1000 × g przez 1 minutę. Przemyć trzykrotnie i ponownie zawiesić nicienie w buforze M9.
   2. Dodać równą objętość roztworu wybielacza i delikatnie mieszać przez 3-5 minut. Monitorować wybielanie co 15 s pod mikroskopem preparacyjnym.
      nuta: Roztwór wybielacza musi być przygotowany świeżo przed użyciem przez zmieszanie równych objętości 10% NaOCl i 1 M NaOH (Tabela 1).
   3. Gdy większość nicieni zostanie rozbita, przerwij trawienie, rozcieńczając buforem M9. Szybko odwirować w celu usunięcia supernatantu i ponownie zawiesić osad w buforze M9, aby powtórzyć płukanie trzy razy.
   4. Zawiesić osad w podłożu S. Pozwól pozostałościom nicieni osiąść grawitacyjnie przez 2-3 minuty, podczas gdy jaja pozostaną w supernatancie.
   5. Zassać supernatant do nowej sterylnej probówki do mikrowirówki. Zebrać jaja przez odwirowanie w temperaturze 1000 × g przez 1 minutę.
   6. Odrzucić ~80% supernatantu i przenieść jaja do sterylnej kolby zawierającej 20 ml pożywki S. Umieścić kolbę w wytrząsarce i inkubować jaja przez noc bez jedzenia z prędkością 120 obr./min, aby uzyskać zsynchronizowane nicienie L1.

2. Testy neurotoksyczności za pośrednictwem PolyQ

1. Leczenie C. elegans próbkami do badań
   1. Aby przygotować nicienie do testu neurotoksyczności polyQ, przenieś 300-500 zsynchronizowanych larw L1 HA759 do każdej studzienki 48-dołkowej płytki z 500 μl pożywki S zawierającej OP50 (OD570 0,7-0,8) i 5 mg / ml astragalanu, zwykle trzy dołek repliki dla każdego zabiegu.
   2. Uszczelnić płytkę parafilmem i inkubować w temperaturze 15 °C i 120 obr./min przez 3 dni.
   3. Zebrać nicienie przez odwirowanie i przemyć 3-5 razy buforem M9. Zawiesić nicienie w buforze M9 do wykorzystania w testach przeżycia i unikania neuronów.
2. Test unikania osmotyki
   1. Podziel bezżywnościową płytkę NGM (9 cm) na normalne (N) i strefy pułapki (T) za pomocą linii 8 M glicerolu (~30 μL) pośrodku. Rozprowadź linię azydku sodu o sile 200 mM (~20 μl) w odległości ~1 cm od linii glicerolu, aby sparaliżować nicienie przechodzące przez barierę glicerolową do strefy T.
   2. Przenieś ~ 200 nicieni każdy do strefy N trzech powtórzonych płytek dla każdej grupy. Dodaj kroplę 1% butanodionu (~ 2 μL) do strefy T (1 cm od krawędzi płytki), aby zwabić nicienie. Natychmiast przykryć pokrywę szalki Petriego i inkubować w temperaturze 23 °C przez 90 minut.
   3. Oceń liczbę nicieni w strefach N i T pod mikroskopem. Oblicz wskaźnik unikania za pomocą równania
      Wskaźnik unikania = N / (T + N)
      Gdzie N i T są liczbą nicieni odpowiednio w strefach N i T. Dane przedstawiono jako średnie ± odchylenia standardowego (SD) trzech powtórzeń, reprezentatywnych dla >3 niezależnych eksperymentów.
   4. Wykonaj niesparowany, dwustronny test t, aby porównać dane z grupy traganka i grupy kontrolnej.

Tabela 1:

rozwiązanie	Wskazówki dotyczące przygotowania	składowanie
1 M CaCl2	111 g CaCl2	Przechowywać w temperaturze pokojowej (RT)
	Dodać dH2O do 1 L
	autoklaw
>1 M Fosforan potasu (pH 6,0)	108,3 g KH2PO4	Przechowuj w RT
	35,6 tys.2HPO4
	Dodać dH2O do 1 L
	autoklaw
1 M MgSO4	246 g MgSO4·7H2O	Przechowuj w RT
	Dodać dH2O do 1 L
	autoklaw
Cholesterol w etanolu (5 mg/mL)	0,5 g cholesterolu	Przechowywać w temperaturze -20 °C
	Dodaj etanol do 100 ml
	Nie sterylizować w autoklawie!
>1 M Cytrynian potasu (pH 6,0)	Dodać 10,0 g monohydratu kwasu cytrynowego	Przechowuj w RT
	Dodać 146,75 g monohydratu kwasu tripotasowego cytrynowego
	Dodać dH2O do 1 L
	autoklaw
Roztwór metali śladowych	0,93 g EDTA disodowego	Przechowuj w ciemności w RT
	0,345 g FeSO4·7H2O
	0,1 g MnCl2·4H2O
	0,145 g ZnSO4·7H2O
	Dodać 0,0125 g CuSO4·5H2O
	Dodać dH2O do 500 ml
	autoklaw
1 M NaOH	4 g NaOH	Przechowuj w RT
	Dodać dH2O do 100 ml
Roztwór wybielacza	0,5 ml 1 M NaOH	Przygotuj świeżo przed użyciem
	0,5 ml 10% NaOCl
Bufor M9	5 g NaCl	Przechowuj w RT
	3 g KH2PO4
	6 g Na2HPO4
	Dodać dH2O do 1 L
	autoklaw
	Dodać 1 ml 1 MMgSO4
S podstawowy	5,85 g NaCl	Przechowuj w RT
	6,0 g KH2PO4
	1,0 g K2HPO4
	Dodać dH2O do 973 ml
	Autoklaw i schłodzić do ~60 °C
	Dodaj 1 ml cholesterolu 5 mg/ml w etanolu
S średni	S podstawowy	Przechowuj w RT
	Dodać 3 ml 1 M CaCl2
	Dodać 3 ml 1 MMgSO4
	Dodać 10 ml 1 M cytrynianu potasu
	Dodać 10 ml roztworu metali śladowych
	Wszystkie elementy zostały poddane autoklawowaniu, nie sterylizować w autoklawie
5 mg/ml astragalanu	0,1 g traganka	Przechowywać w porcjach w temperaturze -80 °C
	Dodać 20 ml pożywki S
	Przefiltruj przez filtr strzykawkowy 0,22 μm
200 mM azydku sodu	1,3 g NaN3	Przechowywać w temperaturze 4 °C
	Dodać 100 ml pożywki S
8 M glicerolu	73,67 g glicerolu	Przechowuj w RT
	Dodać dH2O do 100 ml
10% zapas butanodionu	Zmieszać 10 μl butanodionu z 90 μldH2O	Przechowuj w RT
1% butanodionu	Dodać 10 μl bulionu butanodionu do 90 μldH2O	Przechowuj w RT
1 L kultury Luria-Bertani (LB)	10 g NaCl	Przechowuj w RT
	10 g tryptonu
	5 g ekstraktu drożdżowego
	Dodać dH2O do 1 L
	autoklaw

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Szczepy C. elegans
HA759 rtIs11 [osm-10p::GFP + osm-10p::HtnQ150 + dpy-20(+)]	Centrum Genetyki Caenorhabditis (CGC)		https://cgc.umn.edu/strain/HA759
Szczepy E. coli
NA22	Centrum Genetyki Caenorhabditis (CGC)		https://cgc.umn.edu/strain/NA22
Zobacz materiał OP50	Centrum Genetyki Caenorhabditis (CGC)		https://cgc.umn.edu/strain/OP50
Odczynnik
agar	Szanghaj EKEAR Bio-Technology Co., Ltd.	EQ1001-500G	https://www.ekear.com
Butanodion	Sinopharm Chemical Reagent Co., Sp. z o.o.	80042427	https://www.reagent.com.cn/goodsDetail/d027c00e64c9404d9aa41391fbb 595d0
cholesterol	Sigma-Aldrich	Zobacz materiał C8667	https://www.sigmaaldrich.cn/CN/zh/product/sigma/c8667?context=product
glicerol	Aladdin Co., Sp. z o.o.	G116203	https://www.aladdin-e.com/zh_cn/g116203.html
Pepton	Guangdong HuanKai Nauka i technologia mikrobiologiczna Co., Ltd.	050170B	https://www.huankai.com/show/21074.html
Azydek sodu	Sinopharm Chemical Reagent Co., Sp. z o.o.	80115560	https://www.reagent.com.cn/goodsDetail/5e981aa807664e26af 551E96FF5F07CD
wodorotlenek sodu	Sinopharm Chemical Reagent Co., Sp. z o.o.	10019718	https://www.reagent.com.cn/goodsDetail/450dfdb1132a4d8a817 D3D8C68EC25E6
Roztwór podchlorynu sodu	Fabryka odczynników chemicznych w Kantonie	7681-52-9	http://www.chemicalreagent.com/product/DetailProduct.aspx?id=125
Trypton	Oxoid Sp. z o.o.	LP0042B	https://www.thermofisher.cn/order/catalog/product/LP0042B#/LP0042B
Ekstrakt drożdżowy	Oxoid Sp. z o.o.	LP0021B	https://www.thermofisher.cn/order/catalog/product/LP0021B#/LP0021B
sprzęt
48-dołkowa płytka do hodowli komórkowej	Nest Biotechnology Co., Sp. z o.o.	748001	https://www.cell-nest.com/page94?_l=en&product_id=85
Szalka Petriego 90 mm	Sangon Biotech (Szanghaj) Co., Ltd.	F611003	https://www.sangon.com/productDetail?productInfo.code=F611003
autoklaw	Panasonic	MLS-3781L-PC
Mikroskop preparacyjny	ChongQing Optical Co., Sp. z o.o.	ZSA0745	http://www.coicuop.com/plus/view.php?aid=64
Mikrowirówka	Firma GeneCompany	GENESPEED X1	https://www.genecompany.com/index.php/Home/Goods/goodsdetails/gid/189.html
Parafilm M	Sigma-Aldrich	Zobacz materiał P7793-1EA	https://www.sigmaaldrich.cn/CN/en/product/sigma/p7793?context=product
Shakerze bostońskim	Zhicheng Inc.	ZWY-2102C	http://www.zhicheng.net/Product/0865291356.html