Wszystkie procedury dotyczące modeli zwierzęcych zostały sprawdzone przez lokalny instytucjonalny komitet opieki nad zwierzętami oraz weterynaryjną komisję rewizyjną JoVE.
UWAGA: Zobacz Tabelę 1, aby zapoznać się z recepturami rozwiązań używanych w tym protokole.
1. Przygotowanie materiałów do testu Caenorhabditis elegans
- Utrzymanie szczepów C. elegans
- Otrzymać szczepy C. elegans (AM141 i HA759) i Escherichia coli (OP50 i NA22) (patrz tabela materiałów).
- Utrzymywać nicienie na pożywce wzrostowej nicieni (NGM) wysiane E. coli OP50 w temperaturze 20 °C dla AM141 lub 15 °C dla HA759.
- Przygotowanie kultury bakterii E. coli OP50
- Wybierz pojedynczą kolonię E. coli OP50 z płytki smugowej Luria-Bertani (LB) i zaszczep ją w 50 ml płynnej kultury LB.
- Inkubować bakterie OP50 w wytrząsarce w temperaturze 37 °C i 200 obr./min do uzyskania gęstości optycznej ~0,5 przy 570 nm (OD570).
- Przechowuj kulturę bakterii OP50 w temperaturze 4 °C i zużyj ją w ciągu dwóch tygodni.
- Przygotowanie płytek NGM z bakteriami OP50
- Dodaj 20 g agaru, 2,5 g peptonu, 3,0 g NaCl i 975 ml wody dejonizowanej do butelki o pojemności 1 l. Autoklaw w temperaturze 121 °C przez 30 min.
- Umieść płynną butelkę agarową NGM na stole, aby ostygła do ~60 °C, a następnie dodaj następujące sterylne roztwory podstawowe: 1 ml 1 M CaCl2, 1 ml 1 M MgSO4, 1 ml 5 mg / ml cholesterolu i 25 ml 1 M fosforanu potasu (pH 6,0).
- Wlej 20 ml NGM do sterylnej szalki Petriego o średnicy 90 mm i pozostaw płytki na stole do ostygnięcia i zestalenia. Trzymaj talerze do góry nogami i pozwól im wyschnąć na ławce w temperaturze pokojowej przez 2 dni.
- Dozować 200 μl kultury bakterii OP50 na każdą płytkę NGM i równomiernie rozprowadzić za pomocą sterylnej pałeczki do powlekania szkłem. Zamknąć pokrywki i inkubować płytki przez noc w temperaturze 37 °C.
- Przechowuj płytki NGM wysiane OP50 w plastikowym pudełku z pokrywką w temperaturze pokojowej i zużyj w ciągu dwóch tygodni.
- Przygotowanie populacji C. elegans zsynchronizowanej z wiekiem
- Zebrać grawitacyjne dorosłe nicienie do sterylnej probówki mikrowirówkowej o pojemności 1,5 ml i odwirować przy 1000 × g przez 1 minutę. Przemyć trzykrotnie i ponownie zawiesić nicienie w buforze M9.
- Dodać równą objętość roztworu wybielacza i delikatnie mieszać przez 3-5 minut. Monitorować wybielanie co 15 s pod mikroskopem preparacyjnym.
nuta: Roztwór wybielacza musi być przygotowany świeżo przed użyciem przez zmieszanie równych objętości 10% NaOCl i 1 M NaOH (Tabela 1).
- Gdy większość nicieni zostanie rozbita, przerwij trawienie, rozcieńczając buforem M9. Szybko odwirować w celu usunięcia supernatantu i ponownie zawiesić osad w buforze M9, aby powtórzyć płukanie trzy razy.
- Zawiesić osad w podłożu S. Pozwól pozostałościom nicieni osiąść grawitacyjnie przez 2-3 minuty, podczas gdy jaja pozostaną w supernatancie.
- Zassać supernatant do nowej sterylnej probówki do mikrowirówki. Zebrać jaja przez odwirowanie w temperaturze 1000 × g przez 1 minutę.
- Odrzucić ~80% supernatantu i przenieść jaja do sterylnej kolby zawierającej 20 ml pożywki S. Umieścić kolbę w wytrząsarce i inkubować jaja przez noc bez jedzenia z prędkością 120 obr./min, aby uzyskać zsynchronizowane nicienie L1.
2. Testy neurotoksyczności za pośrednictwem PolyQ
- Leczenie C. elegans próbkami do badań
- Aby przygotować nicienie do testu neurotoksyczności polyQ, przenieś 300-500 zsynchronizowanych larw L1 HA759 do każdej studzienki 48-dołkowej płytki z 500 μl pożywki S zawierającej OP50 (OD570 0,7-0,8) i 5 mg / ml astragalanu, zwykle trzy dołek repliki dla każdego zabiegu.
- Uszczelnić płytkę parafilmem i inkubować w temperaturze 15 °C i 120 obr./min przez 3 dni.
- Zebrać nicienie przez odwirowanie i przemyć 3-5 razy buforem M9. Zawiesić nicienie w buforze M9 do wykorzystania w testach przeżycia i unikania neuronów.
- Test unikania osmotyki
- Podziel bezżywnościową płytkę NGM (9 cm) na normalne (N) i strefy pułapki (T) za pomocą linii 8 M glicerolu (~30 μL) pośrodku. Rozprowadź linię azydku sodu o sile 200 mM (~20 μl) w odległości ~1 cm od linii glicerolu, aby sparaliżować nicienie przechodzące przez barierę glicerolową do strefy T.
- Przenieś ~ 200 nicieni każdy do strefy N trzech powtórzonych płytek dla każdej grupy. Dodaj kroplę 1% butanodionu (~ 2 μL) do strefy T (1 cm od krawędzi płytki), aby zwabić nicienie. Natychmiast przykryć pokrywę szalki Petriego i inkubować w temperaturze 23 °C przez 90 minut.
- Oceń liczbę nicieni w strefach N i T pod mikroskopem. Oblicz wskaźnik unikania za pomocą równania
Wskaźnik unikania = N / (T + N)
Gdzie N i T są liczbą nicieni odpowiednio w strefach N i T. Dane przedstawiono jako średnie ± odchylenia standardowego (SD) trzech powtórzeń, reprezentatywnych dla >3 niezależnych eksperymentów.
- Wykonaj niesparowany, dwustronny test t, aby porównać dane z grupy traganka i grupy kontrolnej.
Tabela 1:
| rozwiązanie | Wskazówki dotyczące przygotowania | składowanie |
| 1 M CaCl2 | 111 g CaCl2 | Przechowywać w temperaturze pokojowej (RT) |
| Dodać dH2O do 1 L |
| autoklaw |
| >1 M Fosforan potasu (pH 6,0) | 108,3 g KH2PO4 | Przechowuj w RT |
| 35,6 tys.2HPO4 |
| Dodać dH2O do 1 L |
| autoklaw |
| 1 M MgSO4 | 246 g MgSO4·7H2O | Przechowuj w RT |
| Dodać dH2O do 1 L |
| autoklaw |
| Cholesterol w etanolu (5 mg/mL) | 0,5 g cholesterolu | Przechowywać w temperaturze -20 °C |
| Dodaj etanol do 100 ml |
| Nie sterylizować w autoklawie! |
| >1 M Cytrynian potasu (pH 6,0) | Dodać 10,0 g monohydratu kwasu cytrynowego | Przechowuj w RT |
| Dodać 146,75 g monohydratu kwasu tripotasowego cytrynowego |
| Dodać dH2O do 1 L |
| autoklaw |
| Roztwór metali śladowych | 0,93 g EDTA disodowego | Przechowuj w ciemności w RT |
| 0,345 g FeSO4·7H2O |
| 0,1 g MnCl2·4H2O |
| 0,145 g ZnSO4·7H2O |
| Dodać 0,0125 g CuSO4·5H2O |
| Dodać dH2O do 500 ml |
| autoklaw |
| 1 M NaOH | 4 g NaOH | Przechowuj w RT |
| Dodać dH2O do 100 ml |
| Roztwór wybielacza | 0,5 ml 1 M NaOH | Przygotuj świeżo przed użyciem |
| 0,5 ml 10% NaOCl |
| Bufor M9 | 5 g NaCl | Przechowuj w RT |
| 3 g KH2PO4 |
| 6 g Na2HPO4 |
| Dodać dH2O do 1 L |
| autoklaw |
| Dodać 1 ml 1 MMgSO4 |
| S podstawowy | 5,85 g NaCl | Przechowuj w RT |
| 6,0 g KH2PO4 |
| 1,0 g K2HPO4 |
| Dodać dH2O do 973 ml |
| Autoklaw i schłodzić do ~60 °C |
| Dodaj 1 ml cholesterolu 5 mg/ml w etanolu |
| S średni | S podstawowy | Przechowuj w RT |
| Dodać 3 ml 1 M CaCl2 |
| Dodać 3 ml 1 MMgSO4 |
| Dodać 10 ml 1 M cytrynianu potasu |
| Dodać 10 ml roztworu metali śladowych |
| Wszystkie elementy zostały poddane autoklawowaniu, nie sterylizować w autoklawie |
| 5 mg/ml astragalanu | 0,1 g traganka | Przechowywać w porcjach w temperaturze -80 °C |
| Dodać 20 ml pożywki S |
| Przefiltruj przez filtr strzykawkowy 0,22 μm |
| 200 mM azydku sodu | 1,3 g NaN3 | Przechowywać w temperaturze 4 °C |
| Dodać 100 ml pożywki S |
| 8 M glicerolu | 73,67 g glicerolu | Przechowuj w RT |
| Dodać dH2O do 100 ml |
| 10% zapas butanodionu | Zmieszać 10 μl butanodionu z 90 μldH2O | Przechowuj w RT |
| 1% butanodionu | Dodać 10 μl bulionu butanodionu do 90 μldH2O | Przechowuj w RT |
| 1 L kultury Luria-Bertani (LB) | 10 g NaCl | Przechowuj w RT |
| 10 g tryptonu |
| 5 g ekstraktu drożdżowego |
| Dodać dH2O do 1 L |
| autoklaw |
