Test ran w celu oceny zdolności migracyjnej mysich mioblastów w kokulturze

Streszczenie

Źródło: Toubat, O. et al., Modeling Paracrine Noncanonical Wnt Signaling In Vitro. J. Vis. Exp. (2021).

Ten film opisuje bezkontaktowy test gojenia ran w kokulturze, aby ocenić zdolność migracyjną mysich mioblastów. Pomaga to zrozumieć komponenty wysyłania i odbierania sygnałów parakrynnych niekanonicznych interakcji sygnalizacyjnych Wnt in vitro.

Protokół

1. Test rany:

(Rysunek 1 przedstawia schematyczny model testu)

1. Pozwól, aby wkładki komórek O9-1 i studzienki komory komórkowej C2C12 przylegały i namnażały się w inkubatorze, aż obie komórki osiągną ~70-80% zbiegu przed przystąpieniem do tej części protokołu. Jeśli komórki rosną w >90% zlewają się, nie przystępuj do testu zarysowania, ponieważ komórki po prostu oderwą się od studni.
2. Podgrzej 1x PBS i C2C12, umieszczając je w łaźni wodnej o temperaturze 37 °C.
3. Dobrze usunąć pożywkę sklarowaną nad osadem z komory C2C12 i przemyć komórki raz 1x PBS. Wyjmij 1x PBS i natychmiast zarysuj komórki sterylną końcówką pipety P10.
   1. Przesunąć sterylną końcówkę pipety P10 mocno w jednym kierunku, aby objąć całą długość lub szerokość monowarstwy ogniwa (np. od prawej do lewej, od góry do dołu). Pamiętaj, aby zadrapać każdą studzienkę zawierającą komórki tylko raz.
      nuta: Aby zoptymalizować wyniki drapania, zdrapuj studzienki w różnych warunkach eksperymentalnych na podobnym poziomie zbieżności. Aby to zrobić, upewnij się, że każda studzienka 4-komorowa ma komórki dla każdego wymaganego warunku eksperymentalnego (np. studnia #1 kontrola ujemna, studnia #2 kontrola pozytywna). Ponadto do każdego zadrapania należy używać nowej sterylnej pipety P10 i za każdym razem przykładać do niej podobną siłę. Nie próbuj tworzyć więcej niż jednej rysy w każdym dołku.
   2. Po zdrapaniu szybko dodaj 1 ml 1x PBS z powrotem do studzienki za pomocą końcówki do pipety P1000. Powtórz ten proces dla każdej studzienki, która zostanie porysowana.
      nuta: Biorąc pod uwagę zmienność związaną z każdym zadrapaniem, zaleca się, aby w każdym warunku doświadczalnym stosować wiele studzienek (n = 3) do tworzenia ran. Pracuj szybko, ponieważ bardzo ważne jest, aby zminimalizować czas, przez jaki komórki są pozbawione 1x PBS podczas tych kroków. Po usunięciu 1x PBS z każdej studzienki, nie należy potrzebować więcej niż 5 sekund, aby wytworzyć ranę w każdym dołku.
4. Po wygenerowaniu rany i dodaniu 1x PBS z powrotem do każdej studzienki, zobrazuj rysę za pomocą mikroskopu odwróconego jasnego pola i użyj tego obrazu jako wyjściowego rozmiaru rany (czas 0). Aby zrobić zdjęcia, wykonaj następujące czynności:
   1. Włącz komputer i mikroskop (patrz Spis materiałów), naciskając przycisk zasilania. Umieść szkiełko komory na stoliku i obróć tarczę obiektywu do 5-krotnego powiększenia.
   2. Otwórz oprogramowanie do obrazowania (patrz Spis materiałów), klikając dwukrotnie ikonę oprogramowania na pulpicie komputera. Kliknij kartę Kamera na ekranie głównym oprogramowania. Kliknij przycisk Na żywo, aby wyświetlić komórki na karcie AxioCam IC.
   3. Upewnij się, że filtr światła jest całkowicie wysunięty, aby światło mogło przechodzić do aparatu i ekranu komputera. Ręcznie przesuń i/lub obróć suwak komory, aby ustawić obszar rany w środku obrazu na żywo na karcie AxioCam IC.
   4. Aby zrobić zdjęcia, kliknij przycisk snap, aby otworzyć nową kartę obok karty AxioCam IC, która zawiera obraz.
   5. Aby zapisać ten nieruchomy obraz, kliknij plik w lewym górnym rogu strony głównej oprogramowania | Zapisz jako | Wprowadź nazwę pliku w polu Nazwa pliku. Zapisz rysunek w formacie obrazu Carl Zeiss (*.czi) (ustawienie domyślne) i wybierz pulpit na pasku po lewej stronie, aby zapisać plik na pulpicie jako plik .czi, który można otworzyć tylko w oprogramowaniu Zen lite 2012.
   6. Aby zapisać obraz jako .tiff, kliknij polecenie plik | zapisz jako | wprowadź nazwę pliku w polu nazwy pliku. Zapisz rysunek jako oznaczony plik obrazu (*.tiff), klikając przycisk Zapisz jako typ i wybierając *.tiff z menu rozwijanego.
      nuta: Format .tiff można otworzyć w dowolnym oprogramowaniu do przetwarzania obrazu.
   7. Ręcznie zmień położenie szkiełka komory, aby wykonać 2-3 dodatkowe obrazy w innych punktach rany w tym samym dołku.
      nuta: W sumie spowoduje to powstanie 3-4 nienakładających się na siebie, powiększonych obrazów rany w każdym dołku.
5. Wyjmij 1x PBS z każdej studzienki i dodaj 1 ml pożywki C2C12.
   nuta: Należy uważać, aby nie pipetować zbyt agresywnie podczas wyjmowania lub dodawania roztworów do studzienki komory po powstawaniu rany, ponieważ może to spowodować oderwanie się komórek od studzienki. Ponadto należy dobrze przechylić komorę, aby można było przeprowadzić aspirację i ponowne wprowadzenie roztworów w rogach każdej studzienki, aby zminimalizować rozerwanie monowarstwy komórek.
6. Zmontuj system kokultury wkładów studzienkowych, ręcznie umieszczając wkładki zawierające komórki O9-1 w każdym dołku studzienki komory. Delikatnie wepchnij wkładki do studzienki tak, aby spód wkładki znajdował się tuż nad leżącymi poniżej komórkami C2C12. Umieść konstrukty wkładów studzienkowych z powrotem w inkubatorze.
   nuta: Nie pozwól, aby spód wkładki fizycznie dotykał i mechanicznie zakłócał leżące pod spodem ogniwa C2C12.
7. Pozwól komórkom migrować przez łącznie 9-12 godzin. Aby określić optymalny czas migracji, należy sprawdzić komórki po 6 godzinach od powstania rany, a następnie co 2-3 godziny. Zakończ eksperyment, gdy komórki w warunkach kontroli lub kontroli pozytywnej zaczną całkowicie pokrywać ranę.
   nuta: Biorąc pod uwagę bezkontaktowy charakter konstrukcji, leżąca nad nią wkładka nie musi być usuwana ze studzienek podczas sprawdzania postępu migracji interwałowej. Zmienność migracyjna będzie obserwowana w zależności od takich czynników, jak typy komórek użyte w tym teście, gęstość komórkowa w momencie powstawania rany, szerokość utworzonej rany oraz warunki eksperymentalne manipulowanych komórek (np. knockdown genu, addycja rekombinowanego białka). Stężenia tych odczynników należy określić doświadczalnie zgodnie z zaleceniami producenta.

Wyniki

Rysunek 1: Schematyczny model testu.Krok 1 obejmuje ekspansję in vitro mioblastów C2C12 i NCC przy użyciu komórek żywicielskich STO. Etap 2 polega na posiewaniu komórek NCC i C2C12 w systemie kokultury. Krok 3 obejmuje test ran wykonywany w leżących poniżej komórkach C2C12 w celu oceny zdolności migracji komórek. Krok 4 obejmuje barwienie immunologiczne falloidyny w celu oceny architektury ...

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
C2C12 mysia linia komórkowa mioblastów	Kontroler ATCC (Kontroler T	CRL-1772 (wersja cr)
System suwaków komorowych, 4-dołkowy	ThermoFisher Naukowy	154526
Dulbecco's Modified Eagle's Medium (DMEM), wysoki poziom glukozy (4,5 g/l), lglutamina (2 mM)	Corning	10-017-CV	Przechowywany w temperaturze 4 °C
Miarowe i sterylne końcówki do pipet, 10 μl	USA Naukowe	Numer katalogowy: 1111-3810
Linia komórkowa grzebienia nerwowego O9-1	Millipore Sigma	Zobacz materiał SCC049
Bufor fosforanowy (PBS), 1x, bez wapnia i magnezu, pH 7,4	Corning	21-040-CV	Przechowywany w temperaturze 4 °C
Przepuszczalny nośnik Falcon do płytki 24-dołkowej z przezroczystą membraną PET 0,4 μM	Corning	353095
Surowica bydlęca płodu	Fisher Naukowy	Zobacz materiał W3381E	Przechowywane w podwielokrotnościach o pojemności 50 ml w temperaturze -20 °C
Odwrócony mikroskop świetlny Zeiss Axio Vert.A1	Carl Zeiss AG
Oprogramowanie do mikroskopii Zen lite 2012	Carl Zeiss AG		Oprogramowanie do obrazowania