Test immunoenzymatyczny w celu weryfikacji chemicznie sprzężonych koniugatów przeciwciało-antygen

Streszczenie

Źródło: Volckmar, J. et al., Chemiczna koniugacja oczyszczonego przeciwciała skierowanego na DEC-205 z białkiem o pełnej długości do celowania w mysie komórki dendrytyczne in vitro i in vivo. J. Vis. Exp. (2021)

Ten film demonstruje wykrywanie chemicznie sprzężonych kompleksów przeciwciało-antygen za pomocą testu immunoenzymatycznego typu sandwich, czyli ELISA. Przechwycone przeciwciało wiąże się ze specyficznym epitopem antygenu koniugatu przeciwciało-antygen, który można później uwidocznić za pomocą przeciwciała drugorzędowego sprzężonego z enzymem.

Protokół

1. Produkcja αDEC-205 z linii komórkowej hybrydoma NLDC-145

1. W celu wytworzenia przeciwciał należy rozmrozić kriokonserwowane komórki NLDC-145 wytwarzające αDEC-205 w temperaturze 37 °C w łaźni wodnej. Rozprężyć komórki w temperaturze 37 °C i 5% CO₂ . Do rozpoczęcia produkcji przeciwciał potrzebne będą dwie butelki o średnicy 75^cm2. Procedury hodowli komórkowej powinny być wykonywane w komorze bezpieczeństwa, aby zapewnić bezpieczne warunki pracy i zapobiec zanieczyszczeniu kultur.
   1. Zawiesić 1 ml rozmrożonych komórek (1 x 10⁶ - 5 x 10⁶ komórek/ml) w 9 ml pożywki ISF-1 uzupełnionej 1% penicyliną/streptomycyną (wstępnie podgrzaną do 37 °C) w kolbie do hodowli komórkowej (25 cm²). Umieścić kolbę poziomo w inkubatorze do hodowli komórkowych w temperaturze 37 °C, 5% CO₂ .
   2. Hodować komórki w temperaturze 37 °C i 5% CO_{2 ,} aż do 70% konfluencji. Zwykle powinno to nastąpić po 24 - 48 godzinach.
   3. Gdy komórki zlewają się w 70%, przenieś pełną zawiesinę komórek NLDC-145 (10 ml) do stożkowej probówki wirówkowej o pojemności 15 ml za pomocą kontrolera pipet z pipetą w zakresie objętości od 1 do 10 ml. Granulować komórki przez odwirowanie przy 250 x g przez 10 minut w temperaturze pokojowej.
   4. Podgrzać pożywkę ISF-1 do temperatury 37 °C w łaźni wodnej i ponownie zawiesić osad w 12 ml pożywki ISF-1 uzupełnionej 1% penicyliną/streptomycyną. Zawiesinę zawieszonych komórek przenieść do świeżej kolby do hodowli komórkowych (75^cm2).
   5. Hodować i namnażać komórki w pożywce ISF-1 uzupełnionej 1% penicyliny/streptomycyny w temperaturze 37 °C i 5% CO_{2 ,} aż do uzyskania 70% zlewania się i 99% żywotności. Zwykle powinno to nastąpić po 48 - 72 godzinach.
   6. Podziel komórki na dwie kolby o długości^{75 cm 2}. Aby to zrobić, najpierw przepłucz dno kolby hodowli komórkowej/powierzchnię hodowli zawiesiną komórkową, aby usunąć wszystkie komórki NLDC-145 z powierzchni. Przenieść 6 ml zawiesiny komórek NLDC-145 każda do jednej z dwóch świeżych butelek o długości 75^cm2 i dodać wstępnie podgrzane podłoże ISF-1 uzupełnione 1% penicyliną/streptomycyną do 12 ml.
      nuta: Nie odnawiaj pożywki do hodowli komórkowych, ponieważ komórki NLDC-145 będą kondycjonować pożywkę. Przenieś komórki wraz z ich pożywką i napełnij kulturę do pożądanej objętości świeżą pożywką. Ma to kluczowe znaczenie dla żywotności i maksymalnej produkcji przeciwciał przez komórki NLDC-145.
   7. Rozprężyć hodowle komórkowe w temperaturze 37 °C i 5% CO₂ do około 70% zlewania się, co zwykle osiąga się po 48 - 72 godzinach.
   8. Gdy komórki zlewają się w 70%, przenieś 10 ml ekspandowanej zawiesiny komórek NLDC-145 z każdej z butelek o długości^{75 cm 2} do jednej butelki rolkowej PETG (glikol politereftalanu etylenu) (1,050 cm²). W tym celu należy przepłukać dno/powierzchnię kolby hodowli komórkowej zawiesiną komórek, aby usunąć wszystkie komórki z powierzchni za pomocą kontrolera pipet i pipety o pojemności 10 ml.
   9. Dodać 140 ml pożywki ISF-1 uzupełnionej 1% penicyliną/streptomycyną (wstępnie podgrzaną do 37 °C) bezpośrednio z butelki z pożywką do każdej z butelek rolkowych zawierających NLDC-145, napełniając je do oznaczenia 150 ml.
      nuta: Patrz uwaga w kroku 1.1.6.
   10. Hodować butelki rolkowe w temperaturze 37 °C, 5% CO₂ i 25 rund/min przez trzy dni.
   11. Dodać 150 ml pożywki ISF-1 uzupełnionej 1% penicyliną/streptomycyną (wstępnie podgrzaną do 37 °C) do każdej z butelek zawierających NLDC-145, wypełniając je do oznaczenia 300 ml.
   12. Hodowla w butelkach rolkowych zawierających teraz po 300 ml kultury w temperaturze 37 °C, 5% CO₂ i 25 rund / min przez kolejne trzy dni.
   13. Dodać kolejne 100 ml pożywki ISF-1 uzupełnionej 1% penicyliną/streptomycyną (wstępnie podgrzaną do 37 °C) do każdej z butelek rolkowych zawierających NLDC-145, napełniając je w ten sposób do oznaczenia 400 ml.
   14. Hodowla w butelkach rolkowych zawierających teraz po 400 ml kultury w temperaturze 37 °C, 5% CO₂ i 25 rund / min przez kolejne siedem dni.
       nuta: W tym tygodniu kultura staje się bardzo gęsta (do 95% gęstości), a żywotność spada (do zaledwie 50%), umożliwiając maksymalne uwalnianie przeciwciał.
2. W celu oczyszczenia αDEC-205 z supernatantu hodowli zawiesinę komórek NLDC-145 (z obu butelek rolkowych) należy wlać bezpośrednio do 500 ml autoklawowanych butelek wirowych.
   nuta: Należy zebrać całkowitą objętość 800 ml kultury.
   1. Odwirować kulturę przez 30 minut w temperaturze 8 600 x g i temperaturze 4 °C w celu usunięcia komórek i zanieczyszczeń.
   2. Zebrać supernatanty, wyrzucając granulki i umieszczając je w sterylnej butelce z odczynnikiem.
      nuta: Oczyszczanie αDEC-205 można rozpocząć natychmiast (krok 2.) lub supernatant można przechowywać przez krótki czas w temperaturze 4 °C.

2. Oczyszczanie przeciwciała αDEC-205 z supernatantu komórek NLDC-145

UWAGA: Z supernatantu komórkowego NLDC-145, αDEC-205 jest oczyszczany za pomocą kolumny białkowej G Sepharose (wielokrotnego użytku). Wymiary kolumny wynoszą 15 mm x 74 mm, a w każdej kolumnie upakowano 5 ml białka G Sepharose.

1. W celu przygotowania i przemycia kolumny sefarozy białka G należy umieścić hermetyczną gumową zatyczkę w górnym otworze kolumny sefarozy białka G. Nakłuć gumową zatyczkę dwiema sterylnymi kaniulami (20 G x 1 1/2", 0,90 x 40 mm).
   1. Podłącz strzykawkę o pojemności 10 ml do jednej z dwóch kaniul i elastyczną silikonową rurkę (o długości około 100 cm, średnicy 2,5 - 3 mm) z łącznikiem rurki do drugiej kaniuli.
      nuta: Konstrukcja strzykawki/gumowej zatyczki jest wielokrotnego użytku i zapewnia próżnię, co powoduje ciągły przepływ dużej objętości supernatantu hodowlanego do kolumny sefarozy białka G. W tym celu należy lekko odciągnąć tłok strzykawki, aby zapewnić ciągły przepływ płynu w kolejnych krokach.
   2. Przemyć kolumnę 50 ml 0,1 M lodowatego kwasu octowego (pH 2) w celu usunięcia potencjalnie pozostałych przeciwciał z poprzedniego oczyszczania przeciwciałami. Umieść koniec rurki silikonowej w butelce z odczynnikiem wypełnionym 0,1 M lodowatym kwasem octowym (pH 2). W wyniku wywołania próżni 50 ml 0,1 M lodowatego kwasu octowego (pH 2) przepływa kroplami przez kolumnę sefarozy białka G.
      UWAGA: 0,1 M lodowaty kwas octowy (pH 2) należy przechowywać w butelce z odczynnikiem lub świeżo napełniony w zlewce.
   3. Przemyć kolumnę 100-200 ml soli fizjologicznej buforowanej fosforanami (PBS). Umieść koniec silikonowej rurki w butelce lub zlewce z odczynnikiem wypełnionej PBS. Niech 100-200 ml PBS przepłynie kroplami przez kolumnę sefarozy białka G.
2. W celu oczyszczenia przeciwciał z supernatantu NLDC-145 należy załadować 800 ml supernatantu NLDC-145 (otrzymanego z kroku 1.2.2.) na kolumnę. Włóż koniec rurki silikonowej do butelki z odczynnikiem wypełnionym supernatantem NLDC-145. Niech 800 ml supernatantu NLDC-145 przepłynie kroplami przez kolumnę.
   1. Przemyć kolumnę 500 ml PBS. Umieść koniec silikonowej rurki w butelce lub zlewce z odczynnikiem wypełnionej PBS. Niech 500 ml PBS przepłynie kroplami przez kolumnę.
   2. Do elucji użyj 20 probówek o pojemności 1,5 ml i odpipetuj 100 μl 1,5 M Tris-HCl (pH 8,8) do każdej probówki o pojemności 1,5 ml. Wyjąć gumową zatyczkę z kolumny i odpipetować 1 ml 0,1 M glicyny (pH 3) do górnej komory kolumny sefarozy białka G w celu wymycia przeciwciała z kolumny. Zebrać przepływ bezpośrednio jako eluat w jednej z przygotowanych probówek o pojemności 1,5 ml.
   3. Powtórzyć etap elucji (2.2.2) dla wszystkich 20 probówek (1,5 ml).
   4. Oznaczyć gęstość optyczną wszystkich frakcji elucyjnych przy 280 nm (OD₂₈₀) za pomocą spektrofotometru w celu identyfikacji frakcji zawierających przeciwciała.
      nuta: Pierwszą frakcję elucyjną należy użyć jako ślepej.
   5. Połącz wszystkie frakcje o OD₂₈₀ większym niż 0,5 (około 10 frakcji).
   6. Przechowywać kolumnę białkową G Sepharozy wypełnioną 20% etanolem w temperaturze 4 °C.
3. Zebrane elucjacje należy dializować w stosunku do 1000 ml PBS (w zlewce o pojemności 2000 ml) w temperaturze 4 °C przez noc za pomocą rurki dializacyjnej z punktem odcięcia masy cząsteczkowej (MWCO) wynoszącym 12 - 14 kDa.
   1. Pokrój rurkę do dializy na kawałki o długości 20 cm. Gotuj rurkę dializacyjną w 500-800 ml 10 mM EDTA (pH 7,5) przez 30 minut w zlewce, używając gorącej płyty w celu usunięcia zanieczyszczeń. Wyrzuć 10 mM roztworu EDTA (pH 7,5) i gotuj rurkę dializacyjną w wodzie dejonizowanej przez 10 minut
      nuta: Rurka do dializy może być używana bezpośrednio lub przechowywana w 0,01% roztworze azydku sodu (NaN₃)/_H2Ow temperaturze 4 °C do następnego użycia.
   2. Zamknąć dolną część rurki do dializy odpowiednim zamknięciem rurki do dializy/jednoczęściowym, zawiasowym zaciskiem i ostrożnie odpipetować elucję przeciwciał do rurki dializy. Zamknąć górną część rurki do dializy za pomocą drugiego zacisku.
   3. Przymocuj górny zacisk rurki do dializy do pływającego stojaka, umieść go razem z mieszadłem magnetycznym w zlewce wypełnionej PBS i umieść zlewkę na mieszadle magnetycznym.
   4. Dializować przez noc, mieszając w temperaturze 4 °C.
4. Aby zwiększyć stężenie αDEC-205, należy załadować cały dializ do koncentratora odśrodkowego o stężeniu 10 kDa MWCO. Otworzyć jeden zacisk rurki i ostrożnie odpipetować cały dialilat z rurki dializacyjnej do koncentratora odśrodkowego (10 kDa MWCO).
   nuta: Nie dotykaj dna koncentratora końcówką pipety.
   1. Wirować przez 30 minut przy 693 x g (2 000 obr./min) i 4 °C.
   2. Załadować koncentrator odśrodkowy 10 ml PBS i odwirować przy 693 x g (2 000 obr./min) i 4 °C, aż ostateczna objętość pozostałego roztworu przeciwciał wyniesie 1-1,5 ml.
      nuta: W razie potrzeby powtórzyć etap wirowania opisany w ppkt 2.4.1. aby dostosować do żądanej kwoty.
   3. Za pomocą spektrofotometru oznacz gęstość optyczną stężonego roztworu αDEC-205 przy 280 nm (OD₂₈₀). Użyj PBS jako pustego.
   4. Oblicz stężenie αDEC-205, korzystając z następującego wzoru:
      stężenie [mg/mL] = OD₂₈₀/1,4.
   5. Przefiltruj roztwór αDEC-205 za pomocą strzykawkowego modułu filtrującego 0,22 μm.
      nuta: Oczyszczanie αDEC-205 z supernatantu komórek hybrydoma NLDC-145 można również osiągnąć za pomocą FPLC (szybkiej chromatografii cieczowej białek). Oczyszczony aparat αDEC-205 można przechowywać w temperaturze 4 °C lub -18 °C w celu długotrwałego przechowywania.

3. Koniugacja chemiczna OVA do αDEC-205

UWAGA: Stosunek 0,5 mg białka OVA do 2,5 mg αDEC-205 (1:5) jest wymagany dla optymalnej koniugacji chemicznej. Jednak stosunek ten może się różnić w przypadku innych białek i przeciwciał i musi być zoptymalizowany pod kątem alternatywnych koniugatów. Redukcję wiązań dwusiarczkowych białka OVA przeprowadza się poprzez inkubację z 30 mM TCEP-HCl, co poddaje grupy sulfhydrylowe do chemicznej koniugacji z αDEC-205 i 240 μl TCEP-HCl jest potrzebne w kroku 3.2. Oba etapy, indukowana przez TCEP redukcja OVA (krok 3.1.) i aktywacja sulfo-SMCC αDEC-205 (krok 3.2.) powinny być najlepiej wykonywane równolegle.

1. Świeżo przygotuj 125 mM roztwór TCEP-HCl (pH 7,0). Odważyć żądaną ilość TCEP-HCl i rozpuścić TCEP-HCl w 0,9 M zasadzie Tris (pH 8,8). Użyj pasków wskaźnika pH, aby sprawdzić pH 125 mM roztworu TCEP-HCl (który powinien być obojętny) i dostosuj pH za pomocą zasady Tris (pH 8,8).
   1. Odpipetować 200 μl roztworu białka OVA (zawierającego 0,5 mg OVA) do sterylnej probówki o pojemności 1,5 ml. Dodać 240 μl 125 mM TCEP-HCl i 560 μl sterylnej ultraczystej wody do białka OVA za pomocą pipety do końcowego stężenia 0,5 mg/ml białka OVA i 30 mM TCEP-HCl (OVA/TCEP-HCl).
      UWAGA: 2,5 mg EndoGrade OVA (liofilizowany) rozpuszcza się w 1 ml PBS, dając roztwór OVA o stężeniu 2,5 mg/mL.
   2. Inkubować powstały OVA/TCEP-HCl w temperaturze pokojowej przez 1,5 h.
      nuta: Nie należy przedłużać tego etapu inkubacji.
2. Aby aktywować αDEC-205 do koniugacji, rozpuść 2 mg sulfo-SMCC w 100 μl ultraczystej wody.
   nuta: Sulfo-SMCC jest podatny na hydrolizę. W związku z tym należy szybko obchodzić się z większymi ilościami nierozpuszczonego sulfo-SMCC lub użyć dostępnych podwielokrotności 2 mg.
   1. Rozcieńczyć αDEC-205 w PBS tak, aby 2,5 mg zawierało się w 900 μl.
   2. Wymieszać 2,5 mg αDEC-205 (objętość 900 μl; uzyskana z kroku 3.2.1.) i 100 μl sulfo-SMCC (uzyskana z kroku 3.2.) w probówce o pojemności 1,5 ml, co daje całkowitą objętość 1 ml.
   3. Inkubować roztwór αDEC-205/sulfo-SMCC przez 30 minut w temperaturze 37 °C i 550 obr./min w bloku grzewczym.
3. Po tych inkubacjach nadmiar sulfo-SMCC i TCEP-HCl jest natychmiast usuwany z roztworów za pomocą kolumn odsalających (MWCO 7 kDa; objętość kolumny 5 ml).
   1. Odkręć dolne zamknięcie kolumn (MWCO 7 kDa), poluzuj nasadkę i umieść kolumnę w stożkowej probówce o pojemności 15 ml.
   2. Wirować przez 2 minuty przy 1 000 x g w temperaturze pokojowej w celu usunięcia cieczy.
   3. Umieść kolumnę w świeżej probówce i zdejmij nakrętkę. Powoli załaduj przeciwciało/sulfo-SMCC i OVA/TCEP-HCl, odpowiednio, do środka zwartego złoża żywicy jednej kolumny każdy.
   4. Wirować przez 2 minuty przy 1 000 x g w temperaturze pokojowej.
   5. Po użyciu wyrzuć kolumny. Roztwory zawierające przeciwciało i OVA przygotowane do koniugacji znajdują się w probówkach.
   6. Natychmiast wymieszaj oba roztwory przez pipetowanie w celu sprzężenia αDEC-205 i OVA.
   7. Powstałą mieszaninę αDEC-205 i OVA należy inkubować przez noc w temperaturze 4°C.
4. Po koniugacji nadmiar niezwiązanych OVA jest usuwany z roztworu, a sprzężony αDEC-205/OVA jest zagęszczany za pomocą odśrodkowego koncentratora białek (MWCO 150 kDa).
   1. Odśrodkowy koncentrator białka (MWCO 150 kDa) należy wstępnie przepłukać, pipetując 12 ml PBS na kolumnę i odwirowując przez 2 minuty przy 2 000 x g w temperaturze pokojowej.
      nuta: Jeśli to konieczne, powtórzyć etap wirowania (3.4.1) do momentu, gdy objętość około 5 ml przejdzie przez kolumnę.
   2. Przed załadowaniem αDEC-205/OVA do odśrodkowego koncentratora białek należy zachować 20 μl próbki nieskoncentrowanego αDEC-205/OVA do analizy western blot. Przechowywać tę podwielokrotność w temperaturze 4 °C do czasu analizy.
   3. Załaduj αDEC-205/OVA do odśrodkowego koncentratora białek, pipetując.
      nuta: Unikać kontaktu z łożem górnej komory koncentratora odśrodkowego.
   4. Napełnić koncentrator do 15 ml PBS i odwirowywać koncentrator przez 5 minut przy 2 000 x g w temperaturze pokojowej.
   5. Zachowaj próbkę przepływu (flow-through I) do analizy western blot i wyrzuć pozostałą przepływ
   .
   6. Napełnić koncentrator do 10 ml PBS i odwirowywać koncentrator przez co najmniej 8 minut przy 2 000 x g w temperaturze pokojowej.
   7. Zachowaj próbkę do drugiego przepływu (flow-through II) do analizy Western blot i odrzuć pozostałą przepływ
   .
   8. Po osiągnięciu pożądanego wzbogacenia (około 1,5 ml roztworu αDEC-205/OVA należy pozostawić w górnej komorze), delikatnie zassać zagęszczoną próbkę.
      nuta: Jeśli w górnej komorze pozostanie zbyt dużo płynu, wirowanie można powtórzyć, ale powinno trwać jak najkrócej.
5. Określić stężenie białka w otrzymanym αDEC-205/OVA za pomocą spektrofotometru mikroobjętościowego. Użyj PBS jako pustego.
6. Przefiltruj aparat αDEC-205/OVA za pomocą strzykawkowego modułu filtrującego 0,22 μm.
   nuta: Do późniejszej analizy i eksperymentów in vivo αDEC-205/OVA można przechowywać w temperaturze 4 °C lub -18 °C.

4. Weryfikacja koniugacji chemicznej za pomocą testu ELISA

1. Wykonaj test ELISA w celu dalszej weryfikacji udanej koniugacji chemicznej, w wyniku której powstaje αDEC-205/OVA.
2. Pokryć odpowiednią 96-dołkową płytkę ELISA 100 μl/basenik 3 ng/μl króliczego przeciwciała αOVA w buforze powlekającym (0,1 M wodorowęglan sodu (_NaHCO3) pH 9,6 rozcieńczony w_H2O).
   1. Inkubować płytkę przez noc w temperaturze 4 °C.
3. Po nałożeniu powłoki należy trzykrotnie umyć płytkę PBS, np. za pomocą podkładki ELISA.
4. Zablokować płytkę, pipetując 200 μl buforu blokującego (10% FCS w PBS) do każdego dołka płytki i inkubować płytkę przez 30 minut w temperaturze pokojowej.
5. Seryjnie rozcieńczyć αDEC-205/OVA (otrzymany z kroku 3.6.) w stosunku 1:2 w buforze blokującym (10% FCS w PBS), aby uzyskać rozcieńczenia w zakresie od 6 μg/ml do 93,8 ng/ml αDEC-205/OVA i dodać 100 μL/studzienkę tych zmniejszających się ilości αDEC-205/OVA do studzienek.
   1. Inkubować płytkę przez 1 godzinę w temperaturze pokojowej.
6. Umyj płytkę trzykrotnie PBS, np. za pomocą podkładki ELISA.
7. Dodać 100 μl koziego przeciwciała αrat-IgG+IgM(H+L)-HRPO (rozcieńczonego do 1:2,000 w buforze blokującym (10% FCS w PBS)) do każdego dołka płytki.
   1. Inkubować przez 1 godzinę w temperaturze pokojowej.
8. Umyć płytkę trzykrotnie za pomocą PBS, np. za pomocą podkładki ELISA.
9. Dodać 50 μl substratu HRPO do studzienek. Obserwując klarowną reakcję barwną, należy zatrzymać reakcję poprzez dodanie 150 μl roztworu zatrzymującego (1M H₂SO₄) do studzienki.
10. Po 5 minutach odczytaj absorpcję przy 450 nm za pomocą czytnika ELISA.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
Bufor blokujący (ELISA)			10 % FBS w PBS
Kolba do hodowli komórkowych T25	Greiner Bio-One	690175	używamy standardowych kolb do hodowli komórkowych z nasadką filtracyjną CELLSTAR; alternatywnie używamy kolby do hodowli zawiesinowej (690195 )
Kolba do hodowli komórkowych T75	Greiner Bio-One	658175	używamy standardowych kolb do hodowli komórkowych z nasadką filtracyjną CELLSTAR; alternatywnie używamy kolby do hodowli zawiesinowych (658195)
Kolba do hodowli komórkowych T175	Greiner Bio-One	661175	używamy standardowych kolb do hodowli komórkowych z nasadką filtracyjną CELLSTAR; alternatywnie używamy kolby do hodowli zawiesinowych (661195)
Koncentrator odśrodkowy MWCO 10 kDa	Sartorius Sartorius (Wyspa	VS2001	Koncentrator odśrodkowy Vivaspin 20
Odśrodkowy koncentrator białka MWCO 100 kDa, 5 - 20 ml	Thermo Fisher Naukowy	Numer katalogowy: 88532	Koncentrator białka Pierce, PES 5 -20 ml; używamy koncentratora Pierce Concentrator 150K MWCO 20mL (numer katalogowy 89921), który jednak nie jest już dostępny
Butelki wirówkowe	Nalgene powiedział:	525-2314	PPCO (kopolimer polipropylenu) z nakrętką PP (polipropylen), 500 ml; uzyskany z VWR, Niemcy
Bufor do powlekania (ELISA)			0,1 M wodorowęglan sodu (NaHCO3) w H2O (pH 9,6)
Kolumny odsalające MWCO 7 kDa	Thermo Fisher Naukowy	Numer katalogowy: 89891	Kolumny odsalające Thermo Scientific Zeba Spin, 7K MWCO, 5 ml
Odczynnik do wykrywania ELISA (substrat HRPO)	Sigma-Aldrich/Merck	T8665-100ML	System ciekłego substratu 3,3′,5,5′-tetrametylobenzydyny (TMB)
Płytka 96-dołkowa ELISA	Thermo Fisher Naukowy	442404	Płytka MaxiSorp Nunc-Immuno
Surowica cielęca płodu	PAN-BIOtech	P40-47500	FBS Dobra mocna strona
ISF-1 średni	Biochrom/bioswisstec	F 9061-01
Hybrydoma NLDC-145	Kontroler ATCC (Kontroler T	Zobacz materiał HB-290	jeśli nie masz jeszcze pod ręką, komórki hybrydoma można pozyskać z ATCC
Albumina jaja kurzego	Hyglos (przez BioVendor)	Numer katalogowy: 321000	EndoGrade OVA ultrapure o stężeniu <0,1 EU/mg
Penicylina/Streptomycyna	Thermo Fisher Naukowy	15140122	Można stosować Gibco Penicylina/Streptomycyna 10.000 j./ml; alternatywnie można zastosować Gibco Penicylina/Streptomycyna 5.000 U/ml (15070-063)
Butelki rolkowe do hodowli komórek z politereftalanu etylenu PETG z politereftalanu etylenu	Nunc In Vitro	tel. 734-2394	standardowa powłoka PDL, wentylowana (1,2X), 1050 cm², pojemność 100 - 500 ml; uzyskane z VWR, Niemcy
Paski wskaźnikowe pH	Merck	109535	Paski wskaźnika pH 0-14
Poliklonalne przeciwciało αrat-IgG+IgM-HRPO (ELISA)	Jackson ImmunoResearch (badania immunologiczne Jacksona)	Numer katalogowy: 112-035-068	uzyskany z Dianova, Niemcy; używany w skali 1:2000 dla testu ELISA
Poliklonalny królik αOVA (ELISA)	Księga Abcam	ab181688	Stosowany przy 3 ng/μl
Białko G Kolumna sefarozy	Merck/Millipore	Zobacz materiał P3296	5 ml białka G Sepharose, Fast Flow są pakowane w pustą kolumnę PD-10 (Merck, GE 17-0435-01)
Gumowa zatyczka	Laboratorium Omnilab	5230217	Korki gumowe DEUTSCH & NEUMANN (dolne Φ 17 mm; górne Φ 22 mm)
Rurka silikonowa	Laboratorium Omnilab	5430925	DEUTSCH & NEUMANN (Φ 1 mm wewnętrzna; Φ zewnętrzna 3 mm)
Smukły i szybki			użyliśmy zwykłej czekolady Slim-Fast Chocolate dostępnej bezpłatnie w aptece, ponieważ w tym podejściu western blot przyniosła lepsze rezultaty niż mleko w proszku
Roztwór zatrzymujący (ELISA)			1M H2SO4
Sulfo-SMCC	Thermo Fisher Naukowy	Numer katalogowy: 22322	Pierce Sulfo-SMCC Cross-Linker; alternatywnie użyć numeru katalogowego A39268 (10 x 2 mg)
Filtr strzykawkowy 0,22 μm	Merck/Millipore	SLGV033RS	Millex-GV Filtr strzykawkowy, 0.22 μm, PVDF, 33 mm, sterylizowany promieniami gamma
Strzykawka 10 ml	Laboratorium Omnilab		Strzykawki jednorazowe Injekt® Solo B.Braun
Kaniule Sterican®	B. Brauna		Sterican® G 20 x 1 1/2""; 0,90 x 40 mm; żółty
TCEP-HCl	Thermo Fisher Naukowy	A35349 (A35349
Łącznik do węży	Laboratorium Omnilab		Miniaturowe łączniki rurkowe Kleinfeld do rurki silikonowej

Sar powiedział: powiedział: powiedział: )