Charakterystyka mechanizmów odporności na roślinożerców: przykład pluskwiaków piankowych na gatunkach Brachiaria

Podsumowanie

Niniejszy film wyjaśnia mechanizmy odporności rośliny żywicielskiej na roślinożerność oraz demonstruje test bez wyboru (no-choice test), który pozwala oszacować względny wkład antybiozy i tolerancji w odporność gatunków Brachiaria na spittlebugi.

Streszczenie

Rośliny mogą przeciwstawiać się uszkodzeniom wywołanym przez roślinożerców za pomocą trzech głównych mechanizmów: antyksenozy, antybiozy oraz tolerancji¹. Antyksenoza określa stopień, w jakim roślina jest unikana w sytuacji, gdy roślinożerca może wybrać inne rośliny². Antybioza to stopień, w jakim roślina wpływa na dostosowanie (fitness) żerującego na niej roślinożercy¹. Tolerancja jest stopniem, w jakim roślina może znosić lub naprawiać uszkodzenia spowodowane przez roślinożercę, bez ograniczania wzrostu i reprodukcji tego organizmu¹. Trwałość odporności na roślinożerców w warunkach rolniczych zależy w dużej mierze od mechanizmu odporności preferowanego podczas prac hodowlanych nad roślinami uprawnymi³.

Prezentujemy eksperyment bez możliwości wyboru (no-choice), zaprojektowany w celu oszacowania względnego udziału antybiozy i tolerancji w odporności gatunków Brachiaria na plwaki. Kilka gatunków afrykańskich traw z rodzaju Brachiaria stanowi cenne rośliny paszowe i pastwiskowe w Neotropikach, jednak mogą one zostać dotknięte silnymi żerowiskami kilku rodzimych gatunków plwaków (Hemiptera: Cercopidae)⁴. Aby ocenić ich odporność na plwaki, rośliny są rozmnażane wegetatywnie poprzez sadzonki łodygowe i pozostawione do wzrostu przez około miesiąc, co umożliwia rozwój korzeni powierzchniowych, którymi mogą żerować plwaki. W tym momencie każda roślina testowa jest indywidualnie poddawana infekcji sześcioma jajami plwaków w stadium przed wylęgiem. Infestacje trwają przez miesiąc przed oceną uszkodzeń roślin i przeżywalności owadów. Ocena uszkodzeń roślin pozwala oszacować tolerancję, natomiast ocena przeżywalności owadów dostarcza szacunku antybiozy. Niniejszy protokół wsparł nasze cele hodowlane w zakresie zwiększenia odporności komercyjnych traw brachiaria na plwaki⁵.

Protokół

1. Rośliny

1. Jako jednostki eksperymentalne wykorzystuje się pojedyncze sadzonki pędowe z dojrzałych roślin. Sadzonki przycina się do długości 10 cm, aby zapewnić jednolitość materiału roślinnego.
2. Aby zapobiec zanieczyszczeniu patogenami roślinnymi, sadzonki myje się w 3 % roztworze podchlorynu sodu przez 2 min, a następnie dokładnie płucze wodą z kranu.
3. Każdą sadzonkę sadzi się w ok. 36 g sterylnej gleby w cylindrycznej rurce z PVC (średnica zewnętrzna 5,3 cm, wysokość 6,5 cm), zamkniętej od dołu kubkiem ze styropianu i zakrytej tuleją z PVC. Sadzonkę stabilizuje pierścień z pianki umieszczony w centralnym otworze tulei.
4. Rośliny nawozi się i podlewa w razie potrzeby, aby utrzymać odpowiednią wilgotność gleby.
5. Rośliny rosną przez jeden miesiąc przed wystawieniem na działanie owadów, co pozwala na rozwój korzeni powierzchniowych, które służą jako miejsca żerowania nimf cieniutek żerujących w ksylemie korzenia.
6. Rurki z PVC z ukorzenionymi sadzonkami odwraca się do góry dnem na 8 d przed infestacją, aby dodatkowo stymulować wzrost korzeni powierzchniowych, częściowo niwelując naturalne różnice w architekturze korzeni. Krok ten wymaga sztucznego źródła światła, które zapewniamy przez 24 h na dobę. Aby uniknąć pomylenia uniknięcia żerowania z odpornością na roślinożerców, z eksperymentu usuwa się poszczególne powtórzenia roślin, które po tym zabiegu odwracania mają mało lub wcale nie mają korzeni powierzchniowych. Takie usuwanie powinno zdarzać się rzadko i nigdy nie może prowadzić do wyeliminowania całego reprezentowanego przez nie genotypu.

2. Owady

1. Dorosłe plujawki są zbierane w polu, identyfikowane gatunkowo i przenoszone do klatek do składania jaj, gdzie dostarcza się im liście podatnych traw z rodzaju Brachiaria jako pokarm. Samice składają jaja w glebie znajdującej się w płytkiej, wyjmowanej tacy umieszczonej na dnie klatek.
2. Po kilku dniach glebę zawiesza się w wodzie i przepuszcza przez serię sit (o oczkach 42, 60 i 150 mesh), aby zebrać jaja. Zawieszenie przesianego materiału w 30% roztworze soli powoduje wypłynięcie dojrzałych jaj, pozostawiając niedojrzałe jaja oraz resztki materii organicznej.
3. Aby zapobiec kontaminacji patogenami owadów, jaja dezynfekuje się w 0,5% roztworze podchlorynu sodu przez 5 min, a następnie płucze wodą destylowaną.
4. Każda roślina testowa (jednostka eksperymentalna) jest zaszczepiana na powierzchni gleby sześcioma dojrzałymi jajami. Do infekcji wybiera się wyłącznie dojrzałe jaja bliskie wylęgu. Można je zidentyfikować po obecności dwóch czerwonych kropek w części przedniej, odpowiadających oczom owada; różowych oznaczeń w części tylnej, odpowiadających odwłokowi owada; oraz w pełni rozwiniętej operculum.
5. Pomyślny wylęg potwierdza się po 4 d, po czym każde niewylęgłe jajo zastępuje się nowonarodzoną plujawką z własnej kolonii.
6. Rośliny testowe są rozmieszczone zgodnie z randomizowanym układem blokowym z sześcioma powtórzeniami na genotyp.

3. Ocenia

1. Eksperyment ocenia się około 30 d po infestacji (dokładny czas zależy od badanego gatunku owada).
2. Uszkodzenia ocenia się w skali wizualnej od 1 do 5, gdzie 1 odpowiada brakowi widocznych uszkodzeń, a 5 odpowiada obumarłej roślinie (Rycina 1). Ocena uszkodzeń roślin pozwala na oszacowanie tolerancji.

Rycina 1. Skala uszkodzeń stosowana do oceny tolerancji na żerowanie pianek w gatunkach Brachiaria. 1 = brak wykrywalnych uszkodzeń; 2 = 0-25% nekrozy liści; 3 = 25-50% nekrozy liści; 4 = 50-75% nekrozy liści; 5 = 75-100% nekrozy liści.

3. Przeżywalność owadów ocenia się poprzez zliczanie osobników, które osiągnęły ostatnie stadium larwalne lub stadium imago (Rysunek 2). Ocena przeżywalności owadów pozwala na oszacowanie antybiozy.

Rysunek 2. Rozwój płużnika od pierwszego stadium larwalnego (po lewej) do postaci dorosłej (po prawej). Za „ocalałych” uznaje się wyłącznie owady, które w dacie oceny osiągnęły co najmniej ostatnie stadium larwalne (strzałki).

4. Reprezentatywne wyniki

Wyniki reprezentatywnego testu przesiewowego hybryd Brachiaria pod kątem odporności na pluskwiaka Aeneolamia reducta przedstawiono na rysunku 3.

Rysunek 3. Wyniki przesiewania hybryd Brachiaria pod kątem odporności na pluskwiaka Aeneolamia reducta. Rośliny uznajemy za odporne, jeśli ich reakcja na herbivorię mieści się w dolnej połowie tego wykresu. Antybioza zwiększa się od prawej do lewej, a tolerancja od góry do dołu. Strzałki wskazują nasze odporne kontrolówki.

Dyskusja

Rozróżnienie między mechanizmami odporności na roślinożerców może pomóc w optymalizacji prac nad hodowlą roślin uprawnych³. Odporność oparta na silnej antybiozie mogłaby, w pewnych okolicznościach, stworzyć presję selekcyjną sprzyjającą powstawaniu bardziej agresywnych biotypów szkodników. Z drugiej strony, odporność oparta na tolerancji mogłaby pozwolić na wzrost populacji szkodników, aż do momentu, gdy tolerancja ta zostanie ostatecznie przełamana. Hodowla w kierunku trwałej odporności wymaga zatem starannego rozważenia, które mechanizmy odporności zapewnią największą stabilność dla konkretnego układu roślina/szkodnik [zob. Kennedy et al. (1987) w celu uzyskania szczegółowej dyskusji na ten temat]³.

Ta demonstracja wideo opiera się na kilku wcześniejszych badaniach mających na celu oszacowanie względnego udziału antybiozy i tolerancji w odporności traw z rodzaju Brachiaria na pluskwiaki piankowe^6-9. W przeciwieństwie do testów z wyborem lub eksperymentów polowych, testy bez wyboru gwarantują, że wszystkie rośliny są poddane takiej samej presji roślinożerców, zapewniając tym samym kontrolę nad różnicami wynikającymi z zachowania roślinożerców (np. preferencji gospodarza, agregacji). Z tego powodu testy bez wyboru nie nadają się jednak do oceny odporności wynikającej z antyksenozy.

Sztuczna hodowla kolonii owadów jest preferowaną metodą pozyskiwania owadów testowych do testów przesiewowych w celu oceny odporności¹⁰. Kolonie stanowią niezawodne i jednorodne źródło poskrzewek o znanym wieku, co umożliwia prowadzenie eksperymentów o dowolnej porze roku¹¹. Może jednak konieczne być okresowe wprowadzanie osobników dzikich do kolonii, aby zapewnić, że kolonia nie odbiega genetycznie od odpowiednich populacji polowych¹⁰. Aby ocenić kondycję tych sztucznie hodowanych roślinożerców oraz monitorować ewentualne zmiany w ich agresywności w czasie, ważne jest, aby wszystkie badania przesiewowe obejmowały odpowiednie kontrole o znanych poziomach odporności.

Aby zaprojektować odpowiedni test przesiewowy pod kątem odporności, należy dokładnie zdefiniować wiele parametrów. Do kluczowych parametrów, które uwzględniliśmy przy projektowaniu naszego testu, należą: wiek roślin gospodarzy, gatunek i stadium rozwojowe cystaków, poziom infestacji oraz czas kontaktu rośliny z owadami^8,9,12. Może być konieczne przeprowadzenie kilku serii eksperymentów i udoskonalenie protokołu, aby uzyskać szybki, kosztowo efektywny i wiarygodny test, który w sposób adekwatny przewiduje odporność na roślinożerców w warunkach polowych.