Test komety do wykrywania uszkodzeń DNA w komórkach

Streszczenie

Źródło: Ji, Y., et al. Wysokoprzepustowy test kometowy do oceny uszkodzeń DNA komórek. J. Vis. Exp. (2022).

Film demonstruje test komety do wykrywania uszkodzeń DNA po ekspozycji na szkodliwe czynniki. W warunkach zasadowych DNA rozwija się i denaturuje, a po elektroforezie nieuszkodzone i uszkodzone DNA migruje inaczej w żelu agarozowym, tworząc strukturę w kształcie komety. Wolno migrujące, nieuszkodzone DNA tworzy okrągłą głowę komety, podczas gdy szybko migrujące uszkodzone fragmenty DNA tworzą wydłużony warkocz komety.

Protokół

1. Przygotowanie materiałów do testu komety

1. Przygotowanie preparatów mikroskopowych
   1. Wlać 1% (w/v) agarozy o normalnej temperaturze topnienia [rozpuszczonej w wodzie podwójnie destylowanej (ddH₂O)] do probówki o pojemności 50 ml i mikrofalówki, aby rozpuścić agarozę w ddH₂O. Przechowywać w temperaturze 37 °C, aby zapobiec zestaleniu się przed powlekaniem szkiełek. Jeśli dojdzie do zestalenia, wyrzuć i przygotuj świeże.
   2. Wstępnie pokryj szkiełka mikroskopowe, zanurzając je w probówce o pojemności 50 ml zawierającej 1% (w/v) agarozy o normalnej temperaturze topnienia.
   3. Szybko wytrzyj tylną część szkiełek po zanurzeniu szkiełek.
      nuta: Niewłaściwe wytarcie tylnej części szkiełek zwiększy hałas tła szkiełek podczas analizy pod mikroskopem.
   4. Oznacz powlekane szkiełko trwałym markerem w prawym dolnym rogu matowej części (Rysunek 1A). Pokazuje to, która strona prowadnicy jest wstępnie pokryta.
   5. Pozostaw agarozę do zastygnięcia i wyschnij przez noc w temperaturze pokojowej.
   6. Zawiń wysuszone szkiełka w bibułę i przechowuj je w pudełku.

2. Przygotowanie próbek

1. Hodowane komórki
   nuta: Po pierwsze, należy potraktować komórki czynnikiem uszkadzającym (czynnikami) przed rozpoczęciem testu komety. Następnie wykonaj następujące czynności.
   1. Jeśli komórki przylegają, trypsynizuj komórki, aby uwolnić je z kolby do hodowli komórkowej lub szalki Petriego do hodowli komórkowych, przy odpowiednim zbieganiu się komórek. Zneutralizuj trypsynę, dodając pożywkę zawierającą surowicę.
   2. Przenieść komórki do probówki o pojemności 50 ml, odwirować (np. w przypadku HaCaT odwirować przy 300 x g przez 5 minut w temperaturze pokojowej), delikatnie usunąć supernatant i dodać 1 ml PBS do osadu komórkowego.
   3. Wykonaj zliczanie komórek.
   4. Przenieść 30 000 komórek do probówki mikrowirówkowej o pojemności 1,5 ml i wirować przy 7 607 x g przez 5 minut w temperaturze 4 °C.
   5. Delikatnie usuń supernatant i przechowuj osad komórek na lodzie w ciemności przed wykonaniem testu komety.
      nuta: Komórki powinny być regularnie badane pod kątem zanieczyszczenia Mycoplasma przed wykonaniem testu komety, aby zapobiec, między innymi, powstawaniu artefaktowych uszkodzeń DNA i zmienionej odpowiedzi na uszkodzenia DNA. Warunki wirowania mogą być zmieniane w razie potrzeby, w zależności od użytego typu ogniwa.
2. Przygotowanie hodowanych komórek do testu naprawczego
   1. Hodowla komórek w kolbie do hodowli komórkowej lub na płytkach Petriego.
   2. Umyj komórki 1 ml PBS dwukrotnie przed potraktowaniem komórek czynnikami uszkadzającymi (np. w przypadku komórek BE-M17 należy potraktować 50 μM_H2O2przez 20 minut) na lodzie, aby zapobiec naprawie podczas zabiegu.
   3. Delikatnie umyj komórki dwukrotnie 1 ml PBS, aby usunąć wszelkie pozostałości środków uszkadzających.
   4. Ponownie wprowadzić pożywkę do hodowli komórkowych i pozwolić komórkom na naprawę przez różny czas (np. 0 min, 30 min, 2 h, 6 h, 24 h i 30 h) w wilgotnym inkubatorze (37 °C, 5% CO₂ ).
   5. W każdym punkcie czasowym zbierz 30 000 komórek w pożywce do hodowli komórkowych zawierających 10% dimetylosulfotlenek (DMSO) i przechowuj je w temperaturze -80 °C.
   6. Przed wykonaniem testu kometarnego należy szybko rozmrozić komórki w temperaturze 37 °C w łaźni wodnej i odwirować je w temperaturze 7 607 x g przez 5 minut w temperaturze 4 °C.
   7. Usunąć supernatant i przechowywać osad komórek na lodzie przed wykonaniem testu (tj. od etapu 3).

3. Liza komórek

UWAGA: Wykonaj wszystkie procedury na lodzie.

1. Użyj 12 000 komórek lub 2,5 μl krwi pełnej na żel.
2. Przygotować 0,6% (w/v) niskotemperaturową agarozę rozpuszczoną w PBS za pomocą kuchenki mikrofalowej i umieścić w łaźni wodnej o temperaturze 37 °C, aby zapobiec jej zestaleniu.
3. Oznacz matowy koniec wstępnie powlekanych szkiełek nazwiskiem badacza, datą i informacjami o leczeniu za pomocą markera permanentnego lub ołówka.
4. Umieść płytę chłodzącą na płaskiej ławce i włóż dwa zamrożone pakiety chłodzące do wysuwanej szuflady pod metalową powierzchnią (jak pokazano na rysunku 2).
5. Umieść szkiełka na płycie chłodzącej i pozwól im wstępnie schłodzić się przez 1-2 minuty przed dodaniem komórek zawierających agarozę o niskiej temperaturze topnienia 0,6% (w/v).
   nuta: Pozostawienie szkiełek na płycie chłodzącej na dłużej niż 1-2 minuty może spowodować kondensację pary wodnej na powierzchni szkiełka z powodu wilgotności otoczenia. Może to spowodować, że żele agarozowe o niskiej temperaturze topnienia będą mniej stabilne na szkiełkach.
6. Rozprowadzić osad (etap 2.2.7) przez wirowanie. Upewnij się, że cały sklarowany osad został usunięty z osadu. Umieścić probówki z próbkami (zawierające granulowane komórki) natychmiast z powrotem na lodzie.
   nuta: Umieszczając probówki zawierające próbkę w wirówce, należy je umieścić zawiasem skierowanym na zewnątrz, tak aby osad został zebrany po tej stronie probówki. Czasami trudno jest dostrzec osad i łatwo go usunąć podczas usuwania supernatantu. Wirowanie z pokrywką probówki w tej orientacji pozwoli wiedzieć, gdzie będzie osad komórkowy.
7. Zawiesić osad komórkowy za pomocą 200 μl 0,6% agarozy o niskiej temperaturze topnienia (agarozy LMP) i mieszać, pipetując w górę iw dół, nie tworząc pęcherzyków. Następnie szybko przenieś 80 μl komórek zawierających agarozę LMP na schłodzone szkiełko i szybko umieść szkiełko nakrywkowe na żelu.
8. Pozostaw żel do zastygnięcia na płycie chłodzącej na 1-2 minuty.
9. W międzyczasie przygotuj 500 ml roztworu roboczego buforu do lizy (Tabela 1) i wlej go do naczynia do lizy (Rysunek 3).
10. Po związaniu żeli należy szybko usunąć szkiełka nakrywkowe, delikatnie przytrzymując szkiełko między kciukiem a palcem wskazującym i zsuwając szkiełko nakrywkowe z żelu.
11. Umieść szkiełka zawierające próbki wewnątrz nośnika szkiełka (wszystkie czarne znaki "kropki" na szkiełkach powinny być skierowane w tym samym kierunku, gdy są umieszczone w nośniku) (Rysunek 1B), a następnie umieść nośnik szkiełka wewnątrz naczynia do lizy (Rysunek 3).
12. Zamknij pokrywę naczynia do lizy i przechowuj naczynie do lizy w lodówce przez noc w temperaturze 4 °C lub 30 minut w temperaturze pokojowej, w zależności od tego, co najlepiej odpowiada harmonogramowi operatora.

4. Elektroforeza

1. Ostrożnie wyjmij nośnik szkiełka z naczynia do lizy. Uważaj, aby nie naruszyć żeli.
2. Delikatnie umieść nosidełko szkiełka w naczyniu do mycia wstępnie załadowanym lodowatym ddH₂O i pozostaw na 30 minut, upewniając się, że szkiełka są całkowicie pokryte ddH₂O.
3. Włóż zamrożony pakiet chłodzący do wysuwanej szuflady pod zbiornikiem do elektroforezy, aby utrzymać optymalną temperaturę bufora.
4. Ostrożnie dodać lodowaty roztwór roboczy do elektroforezy (Tabela 1) do zbiornika do elektroforezy i przenieść nośnik szkiełka do zbiornika do elektroforezy. Ustaw szkiełka tak, aby ich przezroczyste części z żelami zawierającymi ogniwa (tj. NIE matowe/etykietujące końce) były skierowane w stronę katody (czerwonej elektrody).
5. Pozostaw szkiełka w zbiorniku do elektroforezy na 20 minut, aby DNA zrelaksowało się i odwinęło. Na tym etapie należy wyłączyć zasilanie.
6. W razie potrzeby włóż nowy zamrożony pakiet chłodzący, aby zmaksymalizować chłodzenie.
7. Wykonuj elektroforezę przez 20 minut przy napięciu 1,19 V/cm lub w innych warunkach, które zostały zoptymalizowane.
   nuta: Optymalizacja warunków pracy elektroforezy i objętości bufora jest zalecana dla każdego laboratorium. Użycie tylko jednego nośnika szkiełka podczas elektroforezy nie powoduje żadnego wpływu szkiełek na rezystancję bufora elektroforezy, a autorzy nie zaobserwowali istotnego wpływu napięcia lub prądu przy zmianie liczby szkiełek.
8. Wyłącz zasilanie, ostrożnie wyjmij nośnik szkiełka ze zbiornika do elektroforezy i pozwól mu spłynąć na bibułce przez 30 sekund.
9. Umieścić nośnik szkiełka w naczyniu zawierającym bufor neutralizacyjny (Tabela 1). Pozostaw na 20 minut.
10. Wyjmij nośnik szkiełka z naczynia neutralizacyjnego, umieść go w naczyniu myjącym zawierającym lodowaty ddH2O i pozostaw na 20 minut.
11. Wyjmij nośnik szkiełka z wody i pozostaw szkiełka do wyschnięcia w inkubatorze w temperaturze 37 °C przez 1 godzinę lub w temperaturze pokojowej przez noc, lub nie suszyć, w zależności od harmonogramu operatora.
    nuta: Jeśli w kroku 4.11 nie ma suszenia, wykonaj etap barwienia z punktu 5.2.

5. Barwienie jodkiem propidyny (PI)

1. Przenieś nośnik szkiełka do naczynia myjącego zawierającego lodowaty ddH₂O w celu nawodnienia szkiełek i pozostaw na 30 minut.
2. Umieść nośnik szkiełka w naczyniu barwiącym zawierającym 2.5 μg/ml roztworu jodku propidyny.
   nuta: Jodek propidyny jest wrażliwy na światło, więc należy go obchodzić w zaciemnionym miejscu. Jest również toksyczny.
3. Zamknij pokrywę naczynia do barwienia i inkubuj je przez 20 minut w ciemności w temperaturze pokojowej.
4. Przenieś nosidełko do osobnego naczynia i myj je lodowatym dnH₂O przez 20 minut.
5. Wyjmij nośnik szkiełka z naczynia i wysusz go całkowicie w ciemności, w inkubatorze o temperaturze 37 °C lub w temperaturze pokojowej, w zależności od harmonogramu lub preferencji operatora.
6. Gdy szkiełka całkowicie wyschną, wyjmij je z nośnika szkiełek i przechowuj w pudełku na szkiełka w ciemności, aż będą gotowe do analizy obrazu.
   nuta: Slajdy pozostaną czytelne przez czas nieokreślony i w razie potrzeby można je ponownie zabarwić.

6. Punktacja komety i analiza danych

UWAGA: Termin "kometa" pochodzi od obrazów uszkodzonych komórek oglądanych pod mikroskopem po przeprowadzeniu testu (Rysunek 4). W warunkach elektroforezy DNA w nieuszkodzonych komórkach w dużej mierze nie migruje, ale pozostaje w sferoidzie określanej jako "głowa" komety. Jednak obecność pęknięć nici pozwala DNA komórki migrować z głowy i utworzyć "ogon", co prowadzi do wyglądu komety (ryc. 4). Im więcej DNA w ogonie, tym więcej uszkodzeń jest obecnych.

1. Włącz mikroskop fluorescencyjny z filtrem PI (czerwonym) (λ = 536/617 nm) i oprogramowaniem do oceny testu komet.
2. Dodaj kroplę wody za pomocą pipety Pasteura do żelu i przykryj szkiełkiem nakrywkowym.
3. Umieść szkiełka w mikroskopie fluorescencyjnym i "nacień" komety.
   nuta: Punktacja jest środkiem, za pomocą którego komety są oceniane, w celu określenia ilości uszkodzeń obecnych w każdej komecie. Ogólnie rzecz biorąc, można to osiągnąć za pomocą dwóch podejść, zgodnie z wybranymi przez użytkownika preferencjami, albo na oko (mierząc rozmiar komet w skali od zera do czterech), albo za pomocą swobodnie dostępnego lub dostępnego na rynku oprogramowania30. Ogólnie rzecz biorąc, oba podejścia oceniają rozmiar warkocza komety, chociaż można określić różne punkty końcowe związane z kometą. Jeśli korzystasz z oprogramowania, kliknij na środek głowy komety i poczekaj, aż oprogramowanie automatycznie wykryje kometę, a następnie oceni wybrany punkt końcowy (Rysunek 4).
4. Zdobądź 50 komet na żel i 100 komet na próbkę (tj. każda próbka odpowiada różnym zabiegom uszkadzania DNA lub ich powtórzeniom).
5. Powtórzyć doświadczenia (n = 2) lub potroić je (n = 3).
   nuta: Jeśli zostanie przeprowadzone tylko n=2 powtórzone eksperymenty, nie można przeprowadzić analizy statystycznej, ale jeśli n=3, należy wykonać test normalności D'agostino. Większość danych z testów komet nie przechodzi testu normalności. W takim przypadku należy użyć testu nieparametrycznego (test Kruskala-Wallisa z testem wielokrotnych porównań Dunna oraz test istotności Manna-Whitneya ustawiony na p < 0,05).

Odczynnik	Roztwór podstawowy	Rozwiązanie robocze
Bufor do lizy	100 mM Na2EDTA, 2,5 M NaCl i 10 mM zasada Tris w ddH2O; dostosować pH do 10 za pomocą 10 M NaOH	1% Triton X-100 w roztworze podstawowym do lizy
Bufor do elektroforezy	10 M NaOH i 200 mM Na2EDTA w ddH2O	300 mM NaOH i 1 mM Na2EDTA; pH > 13
Bufor neutralizacyjny	0,4 M Tris Base w ddH2O; dostosuj pH do 7,5 za pomocą HCl
Bufor do barwienia	1 mg/ml jodku propidyny	2,5 μg/ml jodku propidyny w ddH2O

Tabela 1: Skład odczynników stosowanych w wysokoprzepustowym alkalicznym teście komet (HTP ACA). Pokazano podstawowe i robocze stężenia do lizy, elektroforezy, neutralizacji i barwienia.

Wyniki

Rysunek 1: Reprezentatywne obrazy szkiełka testowego komety i stojaka HTP (nośnika szkiełka mikroskopowego). (A) W celu prawidłowej orientacji, wstępnie pokrytą powierzchnię szkiełka mikroskopowego rozpoznaje się po czarnej kropce w prawym rogu szkiełka mikroskopowego. (B) Obraz stojaka HTP ilustruje, w jaki sposób szkiełka są utrzymywane w ciasnej orientacji pionowej, z wypustkami na nośniku, aby u...

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
Szkiełka nakrywkowe szklane 22 x 22 mm	Fisher Scientific, Hampton, NH, Stany Zjednoczone	631-0124
Mikroskop fluorescencyjny wyposażony z aparatem fotograficznym	Zeiss, Jena, Niemcy
System oznaczania komety HTP	Tasak naukowy	COMPAC- 50
Keratynocyty ludzkie (HaCaT)	Kolekcja kultur typu amerykańskiego (ATCC), Manassas, Wirginia, Stany Zjednoczone	Przerwać	Można kupić w innym firma ADDEXBIO TECHNOLOGIES Kot# T0020001
Nadtlenek wodoru (H2O2) 30% w wodzie	Fisher Scientific, Hampton, NH, Stany Zjednoczone	Zobacz materiał BP2633-500
Oprogramowanie do analizy obrazów i danych	Instrument percepcyjny, Bury St Edmunds, Anglia, Wielka Brytania	125525	Darmowe oprogramowanie do analizy obrazu to dostępne np. ImageJ
Niska temperatura topnienia agarozy	Invitrogen Waltham, Massachusetts, Stany Zjednoczone	Zobacz materiał P4864
Na2 EDTA (disód kwas etylenodiaminotetraoctowy)	Sigma Aldrich, St. Louis, MO, USA	E5134
NaCl (chlorek sodu)	Sigma Aldrich, St. Louis, MO, USA	Zobacz materiał S7653
Nanopure Infinity Ultraczysta woda System (Barnstead Nanopure)	Thermo Scientific, Waltham, MA, USA	Zobacz materiał D11901	Woda ultraczysta (16 MΩ cm^{-1} )
NaOH (wodorotlenek sodu)	Sigma Aldrich, St. Louis, MO, Stany Zjednoczone	E5134
Normalna temperatura topnienia agarozy	Fisher Scientific, Hampton, NH, Stany Zjednoczone	16520100	Do szkiełek do powlekania wstępnego
Jodek propidyny (1,0 mg/ml w wodzie)	Sigma Aldrich, St. Louis, MO, USA	12-541BP486410ML
Mikroskop ze szkła pojedynczego matowego Slajdów	Fisher Scientific, Hampton, NH, Stany Zjednoczone	12-541B
Pudełko na slajdy	Fisher Scientific, Hampton, NH, Stany Zjednoczone	Numer katalogowy: 03-448-2	Odporny na światło, w celu ochrony komórek przed Formacja Przypadkowe uszkodzenie (zgodnie z szeroko rozpowszechnionym poglądem) i zapobiegaj blaknięciu fluorescencyjnego barwnik
Slajd Płyta chłodząca	Tasak Naukowy, Rugby, Anglia, Wielka Brytania	CSL-CHILLPLATE
Naczynie zabiegowe	Tasak Naukowy, Rugby, Anglia, Wielka Brytania	STAINDISH4X
Podstawa Tris	Sigma Aldrich, St. Louis, MO, USA	Numer katalogowy: 93362
Tryton X-100	Fisher Scientific, Hampton, NH, Stany Zjednoczone	Zobacz materiał BP151-500
Trypsyna EDTA (0,5%)	Invitrogen Gibco, Waltham, Massachusetts, Stany Zjednoczone	15400054
Pionowy nośnik prowadnicy	Tasak Naukowy, Rugby, Anglia, Wielka Brytania	COMPAC-25