Test wychwytu aminokwasów znakowany radioaktywnie w celu ilościowego określenia wychwytu aminokwasów przez komórki

Streszczenie

Źródło: Shen, L., et al. Ocena zużycia aminokwasów w hodowanych komórkach kostnych i izolowanych trzonach kostnych. J. Vis. Exp. (2022).

Ten film demonstruje technikę in vitro do szacowania absorpcji aminokwasów przez komórki zrębu pochodzące ze szpiku kostnego. Transportery aminokwasów zależne od Na⁺ pośredniczą w wychwytywaniu aminokwasów znakowanych radioaktywnie wewnątrz komórek, a wychwyt komórkowy szacuje się poprzez pomiar radioaktywności.

Protokół

Użycie materiałów radioaktywnych (RAM) wymaga uprzedniej zgody wyznaczonego komitetu ds. bezpieczeństwa w każdej instytucji.

1. Wychwyt aminokwasów w komórkach

1. Płytka 5 x 10⁴ komórki ST2 w każdym dołku 12-dołkowej płytki do hodowli tkankowej. Komórki płytki w α-MEM zawierające 10% FBS, 100 U/ml penicyliny i 0,1 μg/ml streptomycyny (Pen/Strep). Umieść dodatkowe dołki komórek, aby określić ilościowo liczbę komórek na warunek dla normalizacji w kroku 1.12. Inkubować komórki w wilgotnym inkubatorze do hodowli komórkowych w temperaturze 37 °C z 5% CO₂ .
2. Hoduj komórki przez 2-3 dni, aż do zlewania się.
3. W dniu doświadczenia przygotuj następujące roztwory: 1x sól fizjologiczna buforowana fosforanami (PBS), pH 7,4 i bufor Krebs Ringers HEPES (KRH), pH 8,0: (120 mM NaCl, 5 mM KCl, 2 mM CaCl₂, 1 mM MgCl₂, NaHCO₃, 5 mM HEPES, 1 mM D-Glukoze). Podgrzać do 37 °C.
4. Odessać pożywkę i dwukrotnie przemyć komórki 1 ml 1x PBS, pH 7,4,
   nuta: Protokół ten jest również odpowiedni dla szybko dzielących się komórek niezlewających się. W takim przypadku ważne jest, aby znormalizować radioaktywność do bezwzględnej liczby komórek lub zawartości DNA. Ponadto należy rozważyć zwiększenie rozmiaru płytki hodowlanej lub kolby, aby zwiększyć ogólną liczbę komórek i wartości cpm. Ważne jest, aby ustalić to empirycznie na podstawie indywidualnej.
5. Odessać 1x PBS i przemyć komórki raz 1 ml KRH.
6. Przygotować 4 μCi/ml L-[3,4-3 H]-Glutaminy roboczej, rozcieńczając 4 μL [1 μCi ^μL-1] L-[3,4-3 H]-Glutaminy na 1 ml KRH.
   nuta: Przed użyciem materiałów radioaktywnych należy skontaktować się z Urzędem ds. Bezpieczeństwa Radiologicznego w swojej instytucji macierzystej w celu uzyskania zgód. Wszystkie zabiegi związane z promieniowaniem muszą być wykonywane za osłoną z pleksi.
7. Inkubować komórki z 0,5 ml KRH zawierającego 4 μCi/ml L-[3,4-3 H]-Glutamina robocza przez 5 minut.
8. Zebrać pożywkę radioaktywną i przelać ją do pojemnika na odpady płynne. Umyj komórki trzy razy krótko lodowatym KH, aby zakończyć reakcję. Zebrać i wyrzucić wszystkie płyny do pojemnika na odpady cieczy radioaktywnej.
9. Dodaj 1 ml 1% SDS do każdej studzienki i rozcieraj 10 razy, aby lizować i homogenizować komórki. Przenieś lizaty komórkowe do probówek o pojemności 1,5 ml. Wyrzuć płytki do hodowli komórkowych, pipety serologiczne i końcówki pipet do pojemnika na stałe odpady promieniotwórcze.
10. Wirować przy >10 000 x g przez 10 min. Przenieść supernatanty do fiolek scyntylacyjnych zawierających 8 ml roztworu scyntylacyjnego. Wymieszać, energicznie potrząsając fiolkami scyntylacyjnymi. Wyrzuć probówki i końcówki pipet do pojemnika na stałe odpady radioaktywne.
11. Odczyt radioaktywności w liczbach na minutę (cpm) za pomocą licznika scyntylacyjnego. Wyrzuć fiolki scyntylacyjne do pojemnika na odpady z fiolki scyntylacyjnej.
12. Trypsynizować, ponownie zawiesić i policzyć komórki z pozostałych nieradioaktywnych płytek komórek (patrz krok 1.1), aby oszacować liczbę komórek w zlizowanych, radioaktywnych kulturach. Za pomocą hemocytometru policz liczbę komórek w nieradioaktywnym studzience dla każdego warunku doświadczalnego. Znormalizuj cpm od kroku 1.11 do szacowanej liczby komórek z nieradioaktywnych płytek.
13. Po zakończeniu eksperymentu należy odkazić kaptur do hodowli komórkowej, stół i wszystkie instrumenty za pomocą sprayu odkażającego radioaktywność. Na koniec wykonaj testy wycierania, aby upewnić się, że obszar roboczy jest wolny od promieniowania.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
0,25% trypsyna	Gibco (firma Gibco)	25200
Płytka 12-dołkowa	Corning	3513
Licznik scyntylacyjny Beckman LS6500
Chlorek wapnia	Sigma	Zobacz materiał C1016
chlorek choliny	Sigma	Zobacz materiał C7077
Roztwór D-(+)-glukozy	Sigma	G8769
DPBS (Polskie Biuro Obsługi	Gibco (firma Gibco)	Numer katalogowy: 14190
HEPES(1M)	Gibco (firma Gibco)	Numer katalogowy: 15630
L-[3,4-3H(N)]-Glutamina	PerkinElmer powiedział:	NET551250UC
Fiolki do odcinania płynów	Sigma	Z190535
roztwór chlorku litu, 8M	Sigma	L7026
Chlorek magnezu	Sigma	Zobacz materiał M8266
MEMα	Gibco (firma Gibco)	Numer katalogowy: 12561
Probówka do mikrowirówki, 15 ml	Biotix (Międzynarodowa Organizacja Turystyczna	Numer katalogowy: 89511-256
Chlorek potasu	Sigma	Zobacz materiał P3911
Wodorowęglan sodu	Sigma	Zobacz materiał S6014
chlorek sodu	Sigma	Numer katalogowy S9888
Dodecylosiarczan sodu	Sigma	436143
Ultima Gold (roztwór scyntylacyjny)	PerkinElmer powiedział:	6013329
Kwas α-(metyloamino)izomasłowy	Sigma	Zobacz materiał M2383

szt. SZT. powiedział: Klienta powiedział: powiedział: