1. Zsynchronizowana kultura C. elegans
- Przed wysiewem należy wyhodować szczep Escherichia coli (E. coli) OP50 przez noc w temperaturze 37 °C w 300 ml płynnego podłoża bulionowego Luria-Bertani (LB). Przechowywać kulturę OP50 w temperaturze -4 °C.
- Aby przygotować płynne podłoże bulionowe LB, użyj 10 g tryptonu, 5 g ekstraktu drożdżowego, 10 g NaCl i 1,5 ml 1 N NaOH i dodaj do 1 l z wodą dejonizowaną. Autoklaw.
nuta: Szczepy OP50 i C. elegans są dostępne w Caenorhabditis Genetics Center (University of Minnesota, St. Paul, MN, USA).
- Aby zrobić agar z pożywką do wzrostu nicieni (NGM), użyj 3 g NaCl, 2,5 g peptonu, 17 g agaru i 975 ml wody dejonizowanej. Autoklaw. Schłodzić do temperatury 55 °C, a następnie sterylnie dodać kolejno 1 ml 1 M MgSO4, 1 ml 1 M CaCl2, 1 ml 5 mg/ml cholesterolu w EtOH i 25 ml 1 M fosforanu potasu o pH 6,0 na 90-milimetrowych szalkach Petriego.
- Dla 1 M fosforanu potasu o pH 6,0 należy użyć 108,3 g KH2PO4 i 46,6 g K2HPO4 i dodać wodę dejonizowaną do 1 L. Autoklaw.
- Rozprowadź 1-2 ml kultury OP50 na płytkach agarowych NGM. Aby uzyskać cienką warstwę OP50, inkubuj płytki przez noc w temperaturze pokojowej przed dodaniem jakichkolwiek nicieni.
nuta: Płytki agarowe NGM zaszczepione OP50 można przechowywać w temperaturze pokojowej przez 2-3 tygodnie.
- Dodać co najmniej 100 robaków na płytkę agarową NGM z OP50 i hodować w temperaturze 20 °C aż do osiągnięcia wieku dorosłego. Wymagane są co najmniej trzy płytki.
- Aby zebrać jaja w macicy, przenieś grawitacyjne hermafrodyty z trzech płytek agarowych NGM, z których każda zawiera 5 ml buforu S w stożkowej probówce o pojemności 15 ml i umyj robaki 3 razy 15 ml buforu S za pomocą wirowania przy 300 x g przez 30 s w temperaturze pokojowej.
- Aby przygotować bufor S, użyj 5,9 g NaCl i 50 ml 1 M fosforanu potasu o pH 6,0 i dodaj do 1 l z wodą dejonizowaną. Autoklaw.
- Rozpuść robaki w alkalicznym roztworze podchlorynu do aksenizacji i izolacji jaj luzem (0,5 ml świeżego wybielacza lub odpowiednik: 5-6% podchlorynu sodu, 0,1 ml 10 M NaOH, około 4,5 ml buforu S) i odstaw roztwór na 10-15 minut w temperaturze pokojowej z mieszaniem przez odwrócenie.
nuta: W ciągu 15 minut dorosłe robaki powinny się rozpuścić, pozostawiając mętny roztwór jaj uwolnionych z ich tusz (uwolnione jaja należy potwierdzić za pomocą mikroskopu stereoskopowego). Zamiast 0,1 ml 10 N NaOH można również użyć 0,2 ml 5 N NaOH.
- Po potraktowaniu podchlorynem przemyć granulki jaj 3 razy 15 ml buforu S i ponownie zawiesić w 5-6 ml buforu S. Wylęgać uwolnione jaja podczas nocnej inkubacji w temperaturze 20 °C w buforze S bez E. coli w celu przeprowadzenia synchronicznej z wiekiem hodowli larw w stadium L1.
- Aby określić przybliżoną liczbę larw w stadium L1, należy policzyć robaki za pomocą mikroskopu stereoskopowego w 10 μl buforu S po ponownym zawieszeniu larw co najmniej 3 razy i obliczyć średnią. Następnie przenieść larwy w stadium L1 na pięć płytek agarowych NGM z OP50 (1500-3000 robaków na płytkę za pomocą szalki Petriego o średnicy 90 mm) i hodować w temperaturze 20 °C, aż osiągną stadium młodego dorosłego, kiedy rozpoczyna się samozapłodnienie i składa się kilka jaj (zwykle po 3 dniach).
2. Ekstrakcja frakcji komórkowej z C. elegans
- Zebrać robaki w stadium młodego dorosłego (5-dniowe zwierzęta) z pięciu płytek agarowych NGM z buforem S (ryc. 1A).
- Aby wybrać tylko żywe robaki przy użyciu metody sacharozy 6 do flotacji na 30% (w/v) sacharozy, wymieszać robaki zawieszone w 3-4 ml buforu S z równą objętością lodowatej sacharozy 60% (w/v) sacharozy w stożkowej probówce o pojemności 15 ml. Obracać probówkę o masie 1 500 x g przez 15 s w temperaturze 4 °C i usunąć pływające robaki do świeżej probówki, odsuwając je od ścianki probówki za pomocą pipety Pasteura.
- Umyj robaki 3 razy buforem S przez odwirowanie w temperaturze 1 500 x g przez 30 s w temperaturze 4°C. Sprawdź mokrą objętość umytych robaków po odwirowaniu za pomocą końcówki do mikropipet o pojemności 1 000 μl (Rysunek 1B).
- Dodać umyte robaki do równej objętości lodowatego 10% (w/v) kwasu trichlorooctowego (TCA; końcowe stężenie 5%) w celu wytrącenia białka (Rysunek 1C). Zamiast TCA można zastosować kwas nadchlorowy (PCA) lub kwas metafosforowy.
- Homogenizuj robaki ze środkiem strącającym za pomocą 40 uderzeń tłuczka w homogenizatorze teflonowym (młynek do tkanek Potter-Elvehjem) z obrotem do 1,300 obr./min na lodzie.
- Przenieś homogenat do świeżej mikroprobówki o pojemności 1,5 ml za pomocą pipety Pasteura i poddaj sonikacji za pomocą homogenizatora ultradźwiękowego przez 3 minuty (3 razy po 1 minutę) z 20% cyklem pracy na lodzie.
- Klarować homogenat przez odwirowanie przy 8 000 x g przez 10 minut w temperaturze 4 °C. Zneutralizować supernatanty za pomocą 4 M KOH (0,25 objętości do 10% TCA) przez 20 minut na lodzie i odwirować przy 8 000 x g przez 10 minut w temperaturze 4 °C. Supernatant (jako próbka badana) może być przechowywany w temperaturze -80 °C do czasu przeprowadzenia następujących testów.
3. Oznaczanie pirogronianu przy użyciu zestawu do testów kolorymetrycznych
- Zmierzyć stężenie pirogronianu w supernatantach (próbkach testowych) za pomocą zestawu do oznaczania kolorymetrycznego (tabela materiałów). Przeprowadzić badania dwustronne dla próbek testowych. Dodać 10 μl badanych próbek i 90 μl odczynnika roboczego (zawierającego 94:1 mieszaniny enzymów i odczynnika barwnikowego, które są dostarczone z zestawem) do 96-dołkowej płytki i inkubować w temperaturze pokojowej przez 30 minut, podczas gdy próbki są chronione przed światłem.
- Zmierzyć absorbancję każdej studzienki przy długości fali 570 nm za pomocą czytnika mikropłytek.
- Wykreślić krzywą standardową pirogronianu. Obliczyć stężenia pirogronianu w badanych próbkach na podstawie krzywej wzorcowej pirogronianu.
