Test spektrofotometryczny w celu określenia aktywności syntazy glikogenu

Streszczenie

Źródło: Wilson W.A., href="https://app.jove.com/v/63046">Metody spektrofotometryczne do badania metabolizmu glikogenu eukariotycznego. J. Vis. Exp. (2021).

Ten film opisuje test spektrofotometryczny do szacowania aktywności syntazy glikogenu. Metoda polega na zmniejszaniu się absorbancji NADH w czasie i wskazuje na aktywność syntazy glikogenu.

Protokół

1. Oznaczanie aktywności syntazy glikogenu

1. Przygotować roztwory podstawowe wymaganych odczynników, jak wskazano w Tabeli 1 (przed dniem doświadczalnym).
2. W dniu testu należy przygotować świeży roztwór roboczy o stężeniu 4 mM NADH, rozpuszczając 4,5 mg NADH w 1,5 ml 50 mM Tris-HCl, pH 8,0. Przechowywać na lodzie, chronić przed światłem.
3. Rozmrozić na lodzie roztwory podstawowe UDP-glukozy, ATP, fosfoenolopirogronianu i kinazy NDP.
4. Podgrzej łaźnię wodną do temperatury 30 °C.
5. Ustawić każdy test syntazy glikogenu w probówce o pojemności 1,5 ml, dodając odczynniki mieszaniny reakcyjnej wymienione w tabeli 2.
   nuta: Aby ułatwić przygotowanie, można przygotować mieszankę wzorcową zawierającą wystarczającą ilość każdego z wyżej wymienionych odczynników, aby uzupełnić zaplanowaną liczbę testów.
6. Przygotuj ślepą próbę, w której NADH w powyższej mieszaninie zastępuje się wodą. Przenieść do jednorazowej kuwety z metakrylanem i użyć jej do ustawienia zera na spektrofotometrze na 340 nm.
7. Pobrać jedno 770 μl podwielokrotności mieszaniny reakcyjnej do probówki o pojemności 1,5 ml. Dodać 2 μl kinazy NDP i 2 μl mieszaniny kinazy pirogronianowej / dehydrogenazy mleczanowej, delikatnie wymieszać i inkubować w temperaturze 30 °C przez 3 minuty w celu wstępnego ogrzania mieszaniny reakcyjnej.
8. Dodać 30 μl próbki zawierającej syntazę glikogenu do 20 mM buforu Tris o pH 7,8; wymieszać i przenieść mieszaninę reakcyjną do jednorazowej kuwety z metakrylanu.
9. Umieścić kuwetę w spektrofotometrze i rejestrować absorbancję przy 340 nm w określonych odstępach czasu przez 10 do 20 minut. Wykreślić uzyskane absorbancje w czasie.
   nuta: Należy przeprowadzić reakcję, w której próbkę syntazy glikogenu zastępuje się buforem Tris o stężeniu 20 mM w celu kontroli nieenzymatycznego utleniania NADH. W zależności od czystości próbki mogą być wymagane inne reakcje kontrolne.
10. Określ szybkość reakcji.

Tabela 1: Roztwory podstawowe wymagane do oznaczania aktywności syntazy glikogenu.

składnik	Wskazówki dojazdu
50 mM Tris pH 8,0	Rozpuść 0,61 g zasady Tris w ~ 80 ml wody. Schłodzić do 4 °C. Dostosować pH do 8,0 za pomocą HCl i uzupełnić objętość do 100 ml wodą.
Bufor HEPES 20 mM	Rozpuść 0.477 g HEPES w ~ 80 ml wody. Doprowadzić pH do 7,0 za pomocą NaOH i uzupełnić objętość do 100 ml wodą.
132 mM Tris/32 mM KCl bufor pH 7,8	Rozpuść 1,94 g zasady Tris i 0,239 g KCl w ~90 ml wody. Doprowadzić pH do 7,8 za pomocą HCl i uzupełnić objętość do 100 ml wodą.
0,8% w/v Glikogen ostrygowy	Odważ 80 mg glikogenu ostrygowego i dodaj do wody. Uzupełnij końcową objętość do 10 ml wodą i delikatnie podgrzej/wymieszaj, aby całkowicie rozpuścić glikogen.
100 mM UDP-glukoza	Rozpuść 0,31 g glukozy UDP w wodzie i uzupełnij końcową objętość do 1 ml. Przechowywać w porcjach, zamrożone w temperaturze -20 °C. Stabilne przez kilka miesięcy.
50 mM ATP	Rozpuść 0.414 g ATP w ~ 13 ml wody. Dostosuj pH do 7,5 za pomocą NaOH i uzupełnij objętość do 15 ml wodą. Przechowywać w porcjach zamrożonych w temperaturze -20 °C. Stabilny przez kilka miesięcy.
100 mM Glukozo-6-fosforan pH 7,8	Rozpuść 0.282 g glukozo-6-fosforanu w ~ 7 do 8 ml wody. Dostosuj pH do 7,8 za pomocą NaOH. Uzupełnić objętość do 10 ml wodą. Przechowywać zamrożone w porcjach w temperaturze -20 °C. Stabilne przez co najmniej sześć miesięcy.
40 mM fosfoenolopirogronian	Rozpuść 4 mg fosfoenolopirogronianu w 0,5 ml 20 mM buforu HEPES o pH 7,0. Przechowywać w temperaturze -20 °C. Stabilny przez co najmniej 1 tydzień.
0,5 mln MnCl2	Rozpuść 9,90 g MnCl2 w końcowej objętości 100 ml wody.
Kinaza NDP	Rozpuść liofilizowany proszek w takiej ilości wody, aby uzyskać 1 U/μl roztworu. Przygotować podwielokrotności, zamrozić w ciekłym azocie i przechowywać w temperaturze -80 °C. Stabilny przez co najmniej 1 rok.

Tabela 2: Skład mieszaniny reakcyjnej do oznaczania aktywności syntazy glikogenu.

szt. Rozdział szt.

składnik	Objętość (μl)
160 mM Tris/32 mM KCl bufor pH 7,8	Z kolei 250
Woda	Rozdział 179
100 mM glukozo-6-fosforanu, pH 7,8	Rozdział 58
0,8 % w/v glikogenu ostrygowego	67
50 mM ATP	Rozdział 80
4 mM NADH	Rozdział 80
100 mM UDP-glukoza	28
40 mM fosfoenolopirogronian	20
0,5 mln MnCl2	8
Ostatni tom	770

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
Amylopektyna (bez amylozy) z woskowej kukurydzy	Fisher Naukowy	Nr kat. A0456
Amyloza	Biosynteza Karbosyntez	YA10257
ATP, sól disodowa	MiliporeSigma	A3377
D-glukozo-1,6-bisfosforan, sól potasowa	MiliporeSigma	G6893
D-glukozo-6-fosforan, sól sodowa	MiliporeSigma	Kontroler G7879
Dehydrogenaza glukozo-6-fosforanowa, stopień I, z drożdży	MiliporeSigma	10127655001
Glikogen typu II z ostryg	MiliporeSigma	Klasa G8751
Heksokinaza	MiliporeSigma	11426362001
Kuwety z metakrylanem, 1,5 ml	Fisher Naukowy	14-955-128	Metakrylan jest wymagany, ponieważ niektóre procedury są przeprowadzane przy długości fali 340 nm lub niższej
Sól sodowa fosforanu dinukleotydu β-nikotynamidoadeninowego	MiliporeSigma	N0505
Dinukleotyd β-nikotynamidoadeninowy, zredukowana sól disodowa	MiliporeSigma	Numer katalogowy: 43420
Kinaza nukleozydowa 5'-difosforanowa	MiliporeSigma	N0379
Fosfoenolopirugronian, sól monopotasowa	MiliporeSigma	Zobacz materiał P7127
Fosfoglukututaza z mięśni królika	MiliporeSigma	Zobacz materiał P3397
Fosforylaza A z mięśni królika	MiliporeSigma	Zobacz materiał P1261
Kinaza pirogronianowa/enzymy dehydrogenazy mlekowej z mięśni królika	MiliporeSigma	Zobacz materiał P0294
UDP-glukoza, sól disodowa	MiliporeSigma	U4625

(wersja angielska) powiedział: powiedział: TGL powiedział: powiedział: powiedział: powiedział: