Analiza oparta na impedancji komórkowej do monitorowania procesów komórkowych w czasie rzeczywistym

Streszczenie

Źródło: Labadie, T., et al., Monitorowanie przeżywalności wirusa grypy poza gospodarzem za pomocą analizy komórek w czasie rzeczywistym. J. Vis. Exp. (2021)

W tym filmie pokazujemy proces monitorowania zdarzeń komórkowych w czasie rzeczywistym, w tym proliferację przylegających komórek, za pomocą testu impedancji komórkowej. W tym przypadku przylegające ogniwa działają jak izolatory, ograniczając przepływ prądu między elektrodami i zwiększając impedancję.

Protokół

UWAGA: Podczas wszystkich eksperymentów, trzymaj płytki na powierzchniach nieelektrostatycznych przez cały czas, takich jak papierowe opakowania. Postępuj zgodnie z sekcją 1 poniżej, aby określić najbardziej odpowiednie stężenie komórek do wysiewu na elektronicznej płytce do mikromiareczkowania (zaprojektowanej jako E-Plate).

1. Określenie odpowiedniej ilości komórek do infekowania komórek

1. Przygotować komórki MDCK (Madin-Darby Canine Kidney) w kolbach o długości 75^cm2 w celu uzyskania świeżo podzielonych komórek (około 80% konfluencji) na 24 godziny przed eksperymentem.
2. Umyj komórki 5 ml 1x PBS i odłącz je, dodając 3 ml 0,25% roztworu trypsyny-EDTA.
3. Dodać 7 ml świeżej pożywki do hodowli komórkowych i policzyć komórki za pomocą automatycznego licznika komórek z barwieniem błękitem trypanowym.
4. Dostosuj stężenie komórek do 400 000 komórek/ml za pomocą pożywki do hodowli komórkowych. Wykonaj dwukrotne seryjne rozcieńczenia w dodatkowych probówkach, aby uzyskać gęstość komórek 200 000; 100,000; 50,000; 25,000; 12,500; i 6 250 komórek/ml. Dostosuj zakres rozcieńczania komórek do typu komórki i ich zachowania wzrostu.
5. Pozostawić E-płytkę (tabela materiałów) w temperaturze pokojowej na kilka minut i dodać 100 μl pożywki do hodowli komórkowych do każdej studzienki za pomocą pipety wielokanałowej. Nie dotykaj elektrod E-Plate.
6. Odblokuj podstawki i włóż przedni koniec płytki do kieszeni kołyski przyrządu do pomiaru impedancji (tabela materiałów). Zamknij drzwi inkubatora.
7. Otwórz oprogramowanie.
   1. W polu "Domyślna konfiguracja wzorca eksperymentu" wybierz wybraną podstawkę (podstawki) i kliknij dwukrotnie górną stronę, a następnie wprowadź nazwę eksperymentu. Kliknij "Układ" i wprowadź niezbędne informacje o próbce dla każdego wybranego dołka płyty; następnie kliknij "Zastosuj" po zakończeniu. Kliknij "Zaplanuj" | "Kroki" | "Dodaj krok". Oprogramowanie automatycznie dodaje krok 1 s w celu zmierzenia impedancji tła (CI).
   2. Kliknij "Start/Kontynuuj" w zakładce "Wykonaj". Kliknij "Wykres", dodaj wszystkie próbki, wybierając odpowiednie dołki i upewnij się, że CI wynosi od -0,1 do 0,1 przed przejściem do następnego kroku.
8. Wyjmij płytkę z kołyski.
9. Dodać 100 μl każdej zawiesiny komórkowej z etapu 1.4 po kolei do odpowiednich studzienek i 100 μl pożywki komórkowej do studzienek używanych jako kontrole. Pozostaw płytkę E w okapie z przepływem laminarnym na 30 minut w temperaturze pokojowej, aby umożliwić równomierne rozprowadzenie komórek na dnie studzienek.
10. Włóż płytkę E do kieszeni kołyski. Kliknij "Zaplanuj" | "Dodaj krok" w oprogramowaniu i wprowadź wartości, aby monitorować komórki co 30 minut przez 200 powtórzeń. Następnie wybierz "Start/Kontynuuj".
11. Sprawdź i wykreśl dane CI, klikając przycisk "Drukuj" w oprogramowaniu. Stężenie komórek, które znajdują się tuż przed fazą stacjonarną należy dobrać na płytkę 24 godziny po wysianiu, w celu uzyskania komórek, które podczas infekcji wirusowej są jeszcze w fazie wzrostu. Faza stacjonarna jest osiągana, gdy CI osiąga maksimum.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
E-Plate 16 (6 płyt)	ACEA Biosciences, Inc	5469830001	E-tabliczki są dostępne w różnych opakowaniach
PBS 1X	Technologie życiowe (gibco)	14040091
TPCK-Trypsyna	Worthington	LS003740
xCELLigence Przyrząd do analizy komórek w czasie rzeczywistym S16	ACEA Biosciences, Inc	380601310	Aparaty xCELLigence RTCA S16 są dostępne w różnych formatach (16-dołkowe, 96-dołkowe, jedno lub wielopłytkowe)
75 cm2 kolba do hodowli tkankowych	sokół	430641U
MEM 1X	Technologie życiowe (gibco)	31095029